純種米曲霉發(fā)酵制備陽(yáng)江豆豉及其抗氧化活性研究

周偉光 曾麗珠 張昊

摘 要：本文研究了純種米曲霉發(fā)酵工藝制備陽(yáng)江豆豉的各項(xiàng)參數(shù);探討前發(fā)酵期添加黑豆水解液、后發(fā)酵期添加不同鹽量對(duì)豆豉抗氧化活性的影響。以強(qiáng)抗氧化活性物質(zhì)維生素C為對(duì)照，采用二苯代苦味基肼自由基（DPPH）法、Fe3+還原法和羥基自由基法3種方法檢測(cè)抗氧化活性。結(jié)果顯示，黑豆發(fā)酵過(guò)程中，抗氧化活性逐漸增強(qiáng)，黑豆水解液誘導(dǎo)法純種發(fā)酵制備豆豉的抗氧化活性比傳統(tǒng)工藝純種發(fā)酵豆豉的抗氧化活性強(qiáng)，低鹽后酵的豆豉抗氧化活性效果較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：豆豉;純種米曲霉;發(fā)酵;誘導(dǎo)法;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530006

豆豉是一種以大豆為原料的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在我國(guó)有2000多年的制作和食用歷史[1]。根據(jù)原料不同、制曲微生物不同、發(fā)酵時(shí)是否加食鹽等標(biāo)準(zhǔn)，有不同的分類方法[2]。豆豉含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，不僅能調(diào)味，還可以入藥[3]。其中富含的抗氧化成分，可以清除體內(nèi)自由基，提高機(jī)體抵抗癌癥、冠心病和老年疾病的能力[4，5]。

在傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式和工藝條件下，不同豆豉產(chǎn)品有其特有的風(fēng)味。也因傳統(tǒng)自然發(fā)酵條件變化的限制，存在品質(zhì)不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、風(fēng)味難以控制等問(wèn)題。選用經(jīng)篩選各項(xiàng)性能指標(biāo)優(yōu)良的豉曲作為發(fā)酵菌種，采用適宜的工藝，可以縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)效率，并賦予產(chǎn)品穩(wěn)定的風(fēng)味[6]。

陽(yáng)江豆豉作為廣東傳統(tǒng)特產(chǎn)廣為人知，已有數(shù)百年的生產(chǎn)歷史，暢銷國(guó)內(nèi)市場(chǎng)及東南亞、歐美和大洋洲30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[7]。本文以陽(yáng)江本地黑豆作為原料，以在陽(yáng)江豆豉生產(chǎn)企業(yè)曲房中分離純化的米曲霉為曲種，研究陽(yáng)江豆豉純種發(fā)酵工藝的條件，發(fā)酵過(guò)程中抗氧化物質(zhì)含量的變化[8];研究前發(fā)酵期添加黑豆水解提取液對(duì)調(diào)控豉曲的酶活性，后發(fā)酵期添加不同濃度食鹽對(duì)發(fā)酵速度、發(fā)酵程度和抗氧化物質(zhì)含量的影響[9，10]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

純種米曲霉菌株（本實(shí)驗(yàn)室篩選）;本地黑豆、食鹽（本地超市購(gòu)買）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、MgSO4·7H2O、二苯代苦味基肼自由基（DPPH）、無(wú)水乙醇、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、抗壞血酸、30%過(guò)氧化氫。上述試劑、藥品均為分析純，均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑公司。PDA培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

酸度計(jì)（PHS-25型、上海虹益儀器儀表有限公司）、均質(zhì)器（MJ-25BM01A型、廣東美的精品電器制造有限公司）、可見分光光度計(jì)（722G型、上海儀電分析儀器有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DPH-9082型、上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4型、常州澳華儀器有限公司）、電子分析天平（ALC-210.4型、ACCULAB公司）、高速冷凍離心機(jī)（GT16-2型、廣州市正一科技有限公司）、生物顯微鏡（CX21F51型、OLYMPUS公司）、立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（LX-C35L型、合肥華泰區(qū)療設(shè)備有限公司）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F型、蘇州安泰開啟技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

檢測(cè)食品中抗氧化物質(zhì)含量的方法很多，常用的有二苯代苦味基肼（DPPH）自由基法、Fe3+還原法、羥基自由基法、ABTS法、硫代巴比妥酸（ABARS）法和氧自由基清除能力測(cè)定法（ORAC）等[11]，本文中采用前3種方法。

1.3.1 純種米曲霉孢子懸浮液的制備

米曲霉是豆豉發(fā)酵過(guò)程中起主要作用的微生物，生長(zhǎng)速度快且能分解蛋白質(zhì)和脂類等多種物質(zhì)，純種米曲霉制作豆豉是通過(guò)接種培養(yǎng)的米曲霉孢子來(lái)發(fā)酵的。

采用本實(shí)驗(yàn)室分離保藏的米曲霉（實(shí)驗(yàn)室編號(hào)171020）作為發(fā)酵菌種，用于豆豉的制作。從保存的菌種斜面培養(yǎng)基中挑取少量純種米曲霉孢子，接種于滅菌冷卻后的新鮮PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7d，至斜面培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出大量深綠至墨綠色的孢子;向培養(yǎng)成熟米曲霉的試管斜面中注入無(wú)菌水5mL，輕輕刮取米曲霉孢子洗入無(wú)菌水，再轉(zhuǎn)入已經(jīng)滅菌包含玻璃珠的50mL錐形瓶。重復(fù)上述操作3次，洗脫斜面的孢子。振蕩錐形瓶打散孢子，使其均勻分布于水中。在顯微鏡下使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)錐形瓶?jī)?nèi)的孢子懸濁液進(jìn)行計(jì)數(shù)，可適量向錐形瓶中滴加無(wú)菌水，直至懸浮液中的孢子濃度為C=107個(gè)/mL[12];孢子懸浮液當(dāng)天制備當(dāng)天使用。

1.3.2 黑豆水解液的制備

有研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉對(duì)黑豆中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)利用速度較慢。而黑豆粉中的蛋白質(zhì)通過(guò)酸水解，部分小分子物質(zhì)從黑豆中溶出，經(jīng)離心可獲得含有小分子物質(zhì)的黑豆酸水解液。這些小分子物質(zhì)可以直接被米曲霉利用，雖然含量很低，但其可作為中性蛋白酶合成的誘導(dǎo)劑，提升成曲的酶活力。酶活力的提高可以更充分地將黑豆中的蛋白質(zhì)分解為多肽及氨基酸，為后酵微生物提供更充足營(yíng)養(yǎng)成分，提高豆豉成品的質(zhì)量[13]。黑豆水解液制備流程：黑豆→浸泡→磨漿→調(diào)節(jié)pH→水解→離心→上清液。

1.3.2.1 浸泡

稱取已挑選的無(wú)蟲蝕、無(wú)霉變的黑豆粒15g于50mL離心管，加入45mL蒸餾水，室溫浸泡12h。

1.3.2.2 均質(zhì)

用均質(zhì)器進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)液用3層紗布過(guò)濾，收集濾液。

1.3.2.3 調(diào)節(jié)pH

向?yàn)V液中緩慢滴加0.1M鹽酸，調(diào)節(jié)pH至5.5。

1.3.2.4 水解與離心

將調(diào)節(jié)pH后的濾液置于50℃水浴50min;5000r/min，4℃離心10min，小心移出上層清液到500mL錐形瓶。黑豆水解液不能長(zhǎng)期保存，即制即用。

2 結(jié)果與分析

2.1 純種米曲霉（實(shí)驗(yàn)室編號(hào)171020）的分離鑒定和菌懸液制備 ?本實(shí)驗(yàn)室從陽(yáng)江市豆豉生產(chǎn)企業(yè)的豆醅房指數(shù)生長(zhǎng)期的產(chǎn)品采樣分離取得實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為171020的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為米曲霉（另行發(fā)表）。挑取單孢子接種于PDA斜面擴(kuò)增。

由圖4可知，在后發(fā)酵過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論傳統(tǒng)工藝，還是誘導(dǎo)法制備的豆豉，對(duì)于DPPH自由基的清除能力都有升高的趨勢(shì);在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，誘導(dǎo)法制備豆豉工藝發(fā)酵含鹽量低的豆豉比含鹽量高的豆豉清除DPPH自由基能力更強(qiáng);后發(fā)酵期間，在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，相同鹽含量的豆豉，誘導(dǎo)法制備的豆豉比傳統(tǒng)工藝制備的豆豉具有更高的清除DPPH自由基能力。通過(guò)25d的后發(fā)酵，誘導(dǎo)法制備的豆豉清除DPPH能力基本就會(huì)趨于穩(wěn)定，且清除DPPH的能力最高可提升73.6%。

2.5 對(duì)羥基自由基的清除作用

由圖5可知，在后發(fā)酵過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)法制備豆豉工藝發(fā)酵的豆豉和傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的豆豉，對(duì)于羥基自由基的清除能力都有升高的趨勢(shì);在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，誘導(dǎo)法工藝發(fā)酵含鹽量低的豆豉比含鹽量高的豆豉清除羥基自由基能力更強(qiáng);后發(fā)酵期相同鹽含量的豆豉在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，誘導(dǎo)法工藝制備的豆豉比傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的豆豉具有更高的清除羥基自由基能力。通過(guò)25d的后發(fā)酵，誘導(dǎo)法制備的豆豉清除羥基自由基能力基本就會(huì)趨于穩(wěn)定，且清除羥基自由基的能力最高可提升1倍以上。

2.6 Fe3+還原能力的對(duì)比

由圖6可知，在后發(fā)酵過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)法和傳統(tǒng)工藝制備的豆豉，抗氧化的能力都有升高的趨勢(shì);在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，誘導(dǎo)法工藝含鹽量低的豆豉比含鹽量高的抗氧化活性更強(qiáng);在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，后發(fā)酵期相同鹽含量的豆豉，誘導(dǎo)法制備工藝比傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的豆豉具有更高的Fe3+還原能力，即具有更強(qiáng)的抗氧化活性。通過(guò)25d的后發(fā)酵，誘導(dǎo)法制備的豆豉Fe3+還原能力基本就會(huì)趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

純種米曲霉制曲的豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中，豆豉中抗氧化物質(zhì)含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，抗氧化能力大幅度增強(qiáng)，后期發(fā)酵的過(guò)程是生成高含量抗氧化物質(zhì)的重要階段。

誘導(dǎo)法純種米曲霉制曲豆豉的后發(fā)酵過(guò)程中，添加鹽的濃度對(duì)抗氧化活性有影響，后發(fā)酵相同時(shí)間的豆豉，抗氧化能力隨著鹽的濃度增大而下降。

為了更全面地了解關(guān)于豆豉抗氧化性的相關(guān)知識(shí)，后期發(fā)酵中加入不同濃度氯化鈉溶液，進(jìn)行了豆豉抗氧化性影響的研究，已知低鹽濃度更有利于微生物的生長(zhǎng)，但同時(shí)也增加了產(chǎn)品受到污染的可能性。高鹽濃度不僅不利于微生物的發(fā)酵作用，而且發(fā)酵得到的食品不利于人體健康。

純種米曲霉制備豆豉的后發(fā)酵期，誘導(dǎo)法制備豆豉工藝發(fā)酵得到的豆豉抗氧化能力增長(zhǎng)速度快，能力提升大，傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的豆豉抗氧化能力增長(zhǎng)慢，能力提升小。

本文以陽(yáng)江豆豉為對(duì)象，研究了在豆豉發(fā)酵前期添加適量黑豆水解液研究誘導(dǎo)法制備純種發(fā)酵豆豉的制備條件及抗氧化活性，以期縮短發(fā)酵周期，突破季節(jié)性限制。

3.2 討論

本文中探索了關(guān)于純種米曲霉制曲豆豉的抗氧化活性，對(duì)于豆豉的研究?jī)H僅是冰山一角。未來(lái)還可以開展很多關(guān)于豆豉的其它方面的研究，如傳統(tǒng)工藝制曲發(fā)酵豆豉的抗氧化活性研究、混合菌種制曲發(fā)酵豆豉的抗氧化活性研究、豆豉的微量元素研究、黑豆酸水解液中含有的小分子物質(zhì)種類和組成、誘導(dǎo)蛋白酶作用的機(jī)理等。相信在未來(lái)，會(huì)出現(xiàn)更多關(guān)于豆豉的研究結(jié)果，以幫助人們從豆豉這類常見的食品或藥材中獲得健康飲食。

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（責(zé)任編輯 常陽(yáng)陽(yáng)）