改良法制備冰凍解凍去甘油紅細胞技術的應用〔1〕

張秀華，邱新璐，賴建秀，康美艷，何燕琴

(贛州市中心血站，江西 贛州 341000)

RH(-)血型屬稀有血型，約占3%，目前普通懸浮紅細胞在2～6 ℃保存時間最長為35 d[1]。冰凍紅細胞保存技術主要用于RH(-)血液，以節約血液資源，同時確保臨床RH(-)患者應急輸用[2]。冰凍紅細胞保存技術主要使用復方甘油保護劑，而如何快速解凍并最大程度去除冰凍紅細胞中甘油、上清血紅蛋白含量成分，減少解凍去甘油過程對紅細胞的損耗，有效提高紅細胞的回收率或血紅蛋白含量，保障產品質量的穩定性，對臨床RH(-)血型急救患者及時有效的血液輸注、成功搶救患者生命具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 設備與材料

起始血液：保存6 d內的去白懸浮紅細胞；選用設備：BBS926全自動醫用低速離心機、搖擺機。

1.2 改進前存在的缺點

用南格爾BBS926全自動醫用低速離心機制備冰凍解凍去甘油紅細胞所需時間長，紅細胞回收率低，甘油殘留率和上清血紅蛋白殘留量高。

1.3 方法

2014年7月—2016年6月我站進行實驗，于技術改良前、技術改良后分兩組制備共30袋，原始血液為6 d內的去白懸浮紅細胞的冰凍解凍去甘油紅細胞產品，將其分為改良組和原始組，每組15 袋。通過檢測解凍紅細胞壓積，用于機器自動洗滌去甘油時依次用9%NaCl，9%NaCl加0.9%NaCl，0.9%NaCl進行遞度稀釋細胞內外甘油濃度。改良組制備技術：對南格爾型號為BBS926自動醫用低速離心機進行程序改進，將加甘油后保留所有甘油成分進行冰凍的程序改良為離心去除己甘油化紅細胞中上清成分的100 mL。原始組則在改進前制備，制備方法按照設備廠家最初設定的程序進行。

1.4 觀察指標

按照《全血及成分血質量要求》(GB18469-2012)中的檢測方法[3]，對兩組終產品的游離血紅蛋白含量、甘油殘留量、血小板殘留量以及白細胞殘留量進行檢測，并記錄兩組制備時間。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 兩組終產品各指標的比較

兩組終產品各指標的檢測結果顯示：原始組各項指標均滿足國家標準范圍，證明原始方法所制備的終產品合格。技術改良后，改良組終產品紅細胞回收率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，終產品上清游離血紅蛋白含量、甘油殘留量、血小板殘留量以及白細胞殘留量四項指標比原始組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。以上指標在符合國家標準的基礎上，進一步提升了血液輸注的安全性(見表1)。

2.2 兩組制備1 U時冰凍及溶解時間比較

制備1 U時，改良組下降至0 ℃和-50 ℃所需時間及溶解時間均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

表1 兩組終產品各指標的比較

表2 兩組制備1 U時的冰凍時間及溶解時間比較

2.3 兩組制備2 U時冰凍及溶解時間比較

制備2 U時，改良組下降至0 ℃和-50 ℃所需要時間以及溶解時間均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組制備2 U時冰凍及溶解時間比較

3 討 論

RH(-)血液稀少，為滿足臨床RH(-)患者輸血的需要，血站常需要庫存一定量的RH(-)血液[4]。但是臨床需要RH(-)血型的人員不定或偶有突發事件時需要量超出庫存數量，如果臨時去采集RH(-)血型的血液，招募、采血、檢測等過程會花費較長時間，對于臨床上需要等血救命的患者來說很不利[5]。近年來，我國臨床上對治療用血液的需求量逐年增加，國內研究指出[6]，血液的使用量在許多三甲醫院中逐年增多，具有RH(-)陰性血型的人群在我國占比較少，以人數最多的漢族為例，其中RH(-)血型比例也僅僅只占0.3%～0.5%。因此，為滿足上述需求，提高臨床治療效率以及需求量，利用技術將RH(-)血液進行長期保存，對于目前醫療水平而言是最理想的方法。

為了能給臨床RH(-)患者在最短的時間內輸注安全的血液，我站一直采用南格爾BBS926全自動醫用低速離心機制備冰凍解凍去甘油紅細胞技術，但遇到應急、突發狀況時仍存在問題?；诖?，我站在手工制備冰凍解凍去甘油的基礎上，引進全自動低速離心機，并進行程序改良：將加甘油后保留所有甘油成分進行冰凍的程序改良為離心去除己甘油化紅細胞中上清成分100 mL，提高冰凍紅細胞保存時的冷凍速率，減少解凍時的融化時間，從而減少紅細胞冰凍解凍過程的損耗。兩組終產品各指標的檢測結果顯示：原始組各項指標均符合國家標準，證明原始方法所制備的終產品合格。技術改良后，改良組終產品紅細胞回收率比原始組明顯升高(P<0.05)，上清游離血紅蛋白含量、甘油殘留量、血小板殘留量以及白細胞殘留量四項指標比原始組明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，以上指標在符合國家標準的基礎上，進一步提升了血液輸注安全性。甘油在冰凍保存紅細胞時，是一種天然的細胞內低溫保護劑，對于紅細胞冰凍、解凍時起保護作用[7]。人體紅細胞在低溫下會產生大量冰晶，對紅細胞的細胞膜可能產生機械性損傷，且低溫引起的滲透壓變化也可能使紅細胞內受到化學損傷[8]，甘油對以上兩種損傷都存在保護作用，且劉曉洋等[9]研究指出，甘油同時還可提高紅細胞回收率，應用極為廣泛。但這些紅細胞在投入臨床應用時，甘油必須經過洗滌處理[10]，達到國標所規定的殘留量(<10 g/L)。我站在實際使用中發現，機器洗滌有時也會存在接近于10 g/L的殘留量，因此提出了改進方法。而對于游離血紅蛋白、血小板以及白細胞而言，這三項指標是在紅細胞投入臨床輸血應用時引起患者機體不良或過敏反應的主要因素，需嚴格控制其在終產品中的含量，原始的機器法可達到較為理想的殘留量水平，但我站經過改良后，以上三種物質含量均進一步下降。此外，本次研究結果還顯示：制備1 U和制備2 U時，改良組下降至0 ℃和-50 ℃所需時間及溶解時間均低于原始組，差異具有統計學意義(P<0.05)。機器制備法雖相對于傳統的手工制備法在效率、質量上存在一定優勢，但其在材料資源消耗、制備成本方面存在一定劣勢[11]，這使得提高機器制備法的效率顯得尤為重要。本次改良后的制備程序可有效提高冰凍紅細胞保存時的冷凍速率，減少解凍時融化時間，從而在減少紅細胞冰凍解凍過程損耗的同時，縮短了制備時間，提高了效率。

綜上所述，通過開展冰凍解凍去甘油紅細胞改良制備方法，縮短了冰凍解凍去甘油紅細胞的制備時間，提高了產品紅細胞回收率，進一步降低了甘油殘留率及上清血紅蛋白殘留量，使產品質量保持持續穩定。