人氣道平滑肌原代細胞不同提取方法對比

黃蘭芳 黃青華 李夢澤 侯長春 閆萍

支氣管哮喘是一種表現為可逆性呼氣困難的氣道慢性炎癥[1]，其后期亦有不可逆呼吸困難出現，氣道重塑是哮喘中出現不可逆呼氣困難的原因之一[2，3]。氣道重塑與氣道平滑肌有關，氣道平滑肌的增生、肥大以及基膜增厚均使哮喘患者哮喘發作時出現不可逆呼氣困難，給支氣管哮喘的治療增加難度[4～6]。故氣道平滑肌的培養及研究對探究支氣管哮喘有重要的作用。本研究通過探討兩種不同方法培養氣道平滑肌細胞，觀察其生長特點并對比兩種方法的利弊，為后續細胞實驗做準備。

1 材料與方法

1.1 實驗材料新鮮人支氣管組織、滅菌后pH 為7.2～7.4 的PBS（雷根生物）、高糖DMEM（Gibco）、膠原酶I（賽默飛）、胎牛血清（以色列BI）、青霉素-鏈霉素（BI）、含0.25%EDTA 胰蛋白酶（索萊寶），α-actin 抗體（美國CST），FITC 熒光二抗（索萊寶）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 經與患者簽署知情同意書后，取我院胸外科2019年3～10月行肺葉切除術肺癌患者的正常肺葉、段支氣管標本。將正常肺葉、段支氣管切下后立即放入已加雙抗的冰冷PBS 中，用冰盒運送至實驗室。在超凈臺中用已加雙抗的冰冷PBS 反復清洗支氣管組織3～5 遍，用無菌手術刀將支氣管表面的結締組織刮除，眼科剪剪開支氣管，手術刀輕輕刮除內面內皮組織，小心剔除軟骨、外膜及內皮組織。然后將支氣管轉移至干凈滅菌的5ml 離心管，用眼科剪將組織剪碎，剪成1mm3左右大小的組織塊。將每例標本剪碎的組織塊平均分成2 份，分別用組織塊貼壁法和酶解離法進行細胞培養，并計算成功率和污染率。成功率為成功培養出氣道平滑肌細胞的例數/總例數×100%；污染率為污染的例數/總例數×100%。

1.2.2 組織塊貼壁法 在剪碎的支氣管平滑肌組織中加入一滴血清，用眼科鑷均勻（每個小塊組織相隔0.5～1cm）平鋪于25ml 滅菌培養瓶底面，放置好組織塊后，輕柔翻轉培養瓶，使培養瓶底部朝上，然后置于37℃ 5%CO2培養箱中培養，組織貼壁5～10h后，在無菌條件下沿著側壁向培養瓶內加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 5ml，并翻轉瓶底。繼續放入培養箱中培養，每3～5 天換一次液。每次換液均應輕柔操作，切勿使組織塊移動。

1.2.3 酶解離法 在裝有剪碎的支氣管平滑肌組織的離心管中加入2ml 雙抗高糖DMEM，加入膠原酶I，使其最終濃度為0.1%，封口膠封口，置于37℃5%CO2培養箱中消化3h，然后加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 2ml 終止消化，1 000r/min 離心5min，去上清，加入新鮮含10%胎牛血清的高糖DMEM 5ml，轉移至25ml 滅菌培養瓶中，置于37℃ 5%CO2培養箱中培養，3 天內切勿移動此培養瓶。每3～5 天換一次液。

1.2.4 細胞傳代純化 倒置相差顯微鏡下觀察，組織周圍融合細胞達80%時可用胰蛋白酶消化法傳代。用吸管吸出原培養液，培養瓶中細胞用滅菌雙抗PBS 清洗2 遍，加入含0.25%EDTA 胰蛋白酶1ml，在室溫下消化1～2min，顯微鏡下觀察可見細胞由梭形變為圓形，邊緣透亮，并從瓶壁上脫離出來，輕晃瓶身，見大部分細胞從瓶壁上脫落后，加入含1ml 10%胎牛血清的高糖DMEM 終止消化，用吸管輕輕將殘存在瓶壁上的細胞吹打下來，將混合液轉入離心管中，1 000r/min 離心5min，去上清，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 后分裝至2～3 個新滅菌培養瓶中，置于37℃ 5%CO2培養箱中繼續培養。

1.2.5 細胞鑒定 形態學觀察：倒置相差顯微鏡觀察細胞形態、大小、生長特點及排列方式。細胞免疫熒光鑒定細胞內α-actin：取出1 瓶3～4 代細胞，胰酶消化后分別接種至放置已滅菌蓋玻片的6 孔板中，每孔約105個細胞，待細胞貼壁后，吸掉培養液。用37℃預熱的PBS 于搖床清洗3 次，每次5min。使用4%多聚甲醛液在室溫下固定細胞15min。再用37℃的0.1% TritonX-100 溶液透化處理5min 后，用PBS 于搖床清洗細胞3 次，每次5min。用2%BSA室溫封閉20min 后，用PBS 于搖床清洗細胞3 次，每次5min。取適量配置好的α-actin 單克隆抗體工作液，以覆蓋住玻片上的細胞為宜，4℃過夜。第2 天用PBS 于搖床清洗細胞3 次，每次5min。FITC室溫避光孵育1h 后用PBS 于搖床清洗細胞3 次，每次5min。使用含DAPI 溶液的抗熒光淬滅劑對細胞核進行復染，封片后于熒光顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 細胞培養組織塊貼壁法5～7 天可見有圓形小細胞爬出，細胞貼壁生長，15～20 天生長至融合，約20天鋪滿瓶底80%以上，此時可以首次傳代（見圖1）。酶解離法7～10 天可見細胞增多融合，用胰蛋白酶消化法重鋪細胞后3～5 天可傳代（見圖2）。15 例標本兩種方法原代培養均成功，成功率100%，污染率為0。組織塊貼壁法培養出的細胞能穩定傳代至8～10 代；而酶解離法細胞能傳代至第7 代，到第8 代時細胞形態學開始發生改變。

圖1 組織塊貼壁法（200×）

圖2 酶解離法（200×）

2.2 細胞形態學和免疫熒光染色結果倒置相差顯微鏡觀察兩種方法培養的原代細胞，細胞呈長梭形、紡錘形或者不規則三角形，有1～2 個細胞核。細胞呈“峰-谷”生長（峰：細胞呈多層細胞丘；谷：即單層細胞處，甚至無細胞處）。見圖3A。α-actin免疫熒光染色顯示，兩種方法培養的原代氣道平滑肌細胞95%以上呈強陽性染色，胞漿呈綠色，胞核呈藍色。見圖3B。

圖3 細胞形態和免疫熒光染色

3 討論

許多慢性氣道炎癥后期會出現氣道重構，導致肺功能下降，而氣道平滑肌的改變在呼吸道炎癥及氣道重構的發生、發展過程中具有重要作用。羅雅玲等[7]認為氣道平滑肌是慢性呼吸道疾病中研究價值較高的組成部分，為增加實驗研究的實用性，需培養人氣道平滑肌。然而人氣道平滑肌細胞存在油脂多、貼壁難的特點，且其對無菌環境、培養條件要求高，故現有研究中多用小鼠、大鼠或豚鼠的氣道平滑肌進行原代培養。本研究提供了人氣道平滑肌原代細胞培養的方法及對比，為后續細胞實驗提供基礎。α-actin 是一種具有收縮能力的微絲蛋白，廣泛分布于幾乎所有的肌型細胞中。α-actin蛋白主要用于檢測骨骼肌、平滑肌、血管平滑肌、心肌和肌原性腫瘤。Actin（肌動蛋白）是在所有真核細胞中都表達的高度保守的蛋白質，也是標記平滑肌和肌上皮細胞腫瘤的有效工具。

人氣道平滑肌細胞原代分離培養技術主要有組織塊貼壁法和酶解離法[8，9]。本實驗使用兩種方法均能培養出特異性好、污染率低、純度高的人氣道平滑肌細胞，但培養出細胞的生長速度有明顯差異。組織塊貼壁法培養周期較長，但是細胞形態穩定，活力比酶解離法好，并且原代培養細胞的成功率高。酶解離法培養周期短，雖然也能成功提取原代細胞，但是細胞形態學不穩定，對細胞的活力有一定影響，并且膠原酶價格昂貴。因此我們認為組織塊貼壁法值得推廣使用。此外，本實驗有幾個需要注意的細節：①在手術室中取下患者的氣管組織后需立即放入無菌并加了青霉素-鏈霉素的冰凍PBS 中，用冰盒運送至實驗室，最大程度保持氣管組織的活性。②實驗室內于超凈臺上完成后續步驟。全程盡可能保持無菌操作。用手術刀操作時，動作輕柔但需盡量清除結締組織和內皮細胞，減少后續細胞的純化時間，眼科剪剪碎支氣管組織時可按需求剪至合適大小，一般以1mm3為佳。使用組織塊法進行貼壁時，可向剪碎的支氣管平滑肌組織中加入一滴血清，增加其粘附性；因人氣道平滑肌存在油脂多的特點，較難貼壁，可將貼壁時間適當延長（4～10h），其后再加培養基進行培養。③原代培養時，前3～5 天要求培養瓶絕對靜置，不可移動。④傳代時，細胞與胰蛋白酶作用的時間一般1～2min即可，時間太長對原代細胞造成損害，后續恢復原狀的時間會延長甚至恢復不了正常的梭形形態。離心后去上清時需小心用吸管吸出上清，避免浪費原代細胞。