乳鼠心肌細胞片狀生長的分離、培養及純化

張宇 楊帆

隨著社會進步與人們生活水平提高，心血管疾病的發病率日趨增高并逐步年輕化[1]，心血管疾病研究一直是科研工作者不斷探索及關注的領域。在分子醫學及細胞生物學快速發展的今天，乳鼠心肌細胞是目前心血管疾病研究與治療的主要對象，乳鼠心肌細胞原代培養則是進行心血管疾病研究的最基礎手段[2]。動物體內環境復雜，不利于進行細胞信號轉導通路、基因表達及細胞生理病理學特性等研究，故需要穩定、有效的體外細胞培養模 型[3]。心肌細胞具有培養簡易方便，且實驗重復性好等優點，被認為是進行心臟基因測序及細胞學研究的有效對象，從而推進心臟疾病的治療進程[4]。成熟心肌細胞分離培養難度較大，并且由于每個實驗室體外細胞培養的條件與方法不一致[5，6]，導致原代培養的心肌細胞的存活率、純度等有很大差異，不僅浪費人力物力，而且導致實驗數據不穩定與差異性大等問題，無法滿足實驗需求，影響實驗結果的準確性和可比性。本研究在傳統乳鼠心肌細胞原代分離、培養技術基礎上進行改良，使乳鼠心肌細胞能夠成片狀生長，有利于心肌細胞生理、病理及毒理等的基礎實驗研究進展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生24h 內的C57BL/6J 乳小鼠30只，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗設備 生物安全柜（新加坡ESCO 公司），恒溫培養振蕩器（美國Thermo 公司），CO2恒溫細胞培養箱（美國Thermo 公司），倒置相差光學顯微鏡（德國Leica 公司），倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.1.3 實驗試劑 Dulbecco's Modified Eagle's Medium （DMEM）高糖型培養基（美國Corning 公司），胎牛血清（FBS，以色列BI 公司），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU，美國Sigma 公司），明膠（美國Sigma 公司），0.25%胰蛋白酶（簡稱胰酶，杭州吉諾生物公司），Ⅱ型膠原酶（美國Thermo 公司），青霉素-鏈霉素溶液（簡稱雙抗，杭州吉諾生物公司），Troponin I 兔多克隆抗體（美國Abcam 公司），Dylight488 標記羊抗兔IgG（美國Abcam 公司），TrionX-100（上海碧云天公司），牛血清白蛋白（BSA，美國AMRESCO公司），臺盼藍（北京索萊寶公司），無水乙醇（上海滬試），甲醛（上海滬試），磷酸鹽緩沖液（PBS，杭州吉諾生物公司）。

1.2 試劑配制

1.2.1 培養基A 含體積分數為10% FBS 及1%雙抗配制的DMEM 高糖型培養基。

1.2.2 培養基B 含體積分數為10% FBS、1%雙抗以及0.1mmol/L BrdU 配制的DMEM 高糖型培養基。

1.2.3 消化液 將0.1%胰酶與0.1%膠原酶Ⅱ型混勻，現用現配。

1.3 細胞培養方法

1.3.1 取材 乳小鼠置于75%乙醇中消毒后，移入超凈工作臺，固定其四肢，用無菌眼科剪開胸并取出心臟，剪去心房及結締組織部分，僅留取左心室，放入預冷PBS 中反復清洗血液，并移入另一無菌玻璃皿中，將心室組織剪為1mm3組織塊，在冰上進行上述操作。

1.3.2 細胞消化 第一次消化心室組織：將剪碎后的心室組織移入50ml 離心管，加入10ml 消化液，放入37℃搖床100rpm，15min，棄掉上清，收集沉淀。第二次消化心室組織：將第一次消化后沉淀的心室組織中加入10ml 消化液，37℃搖床100rpm，10min，充分吹打后靜止，待未消化完全細胞沉淀后小心收集上清（避免吸入組織塊）置于20ml 培養液中。重復5～6次消化步驟，至完全消化為止，收集上清。用200μm篩網過濾，1 000rpm，4℃，離心8min，收集上清。

1.3.3 細胞培養 用培養基A 將收集到的細胞懸液再次重懸，接種于T25 培養瓶，放入5% CO2恒溫（37℃）細胞培養箱培養1.5h（即差速貼壁分離法）。將T25 培養瓶中的上清液轉移至另一無菌T25 培養瓶，放入細胞培養箱培養1h，進行第二次差速貼壁。同時，在六孔板中鋪0.5%明膠，置于培養箱中培養1h 備用。收集上清并計數后，離心1 000rpm，4℃，8min，棄上清，留取細胞沉淀。用培養基B 重懸細胞沉淀，按照1.5×105/10cm2的細胞密度接種于包被0.5%明膠的六孔板中，放入細胞培養箱。同時，取200μl 未接種的細胞懸液進行細胞存活率檢測。細胞培養24h 后給予培養基B 換液，前3 天每天使用培養基B 換液培養，以后使用培養基A（即不加BrdU）常規培養。

1.4 細胞形態學觀察、細胞純度及存活率檢測

1.4.1 光學顯微鏡 細胞培養24h 后，于倒置相差光學顯微鏡下觀察。

1.4.2 細胞免疫熒光染色及細胞純度鑒定 實驗前1d 將細胞消化后按照1.5×105/10cm2的細胞密度重新鋪于24 孔板中培養24h。次日，拿出細胞吸出培養基，用預冷PBS 輕柔清洗細胞3 次。用4%甲醛溶液固定10min，預冷PBS 輕柔清洗細胞3 次；用0.2% TritonX-100 破膜10min，預冷PBS 輕柔清洗細胞3 次。3% BSA 室溫封閉1h，預冷PBS 輕柔清洗細胞3 次。加入Troponin I 兔多克隆抗體（一抗濃度1∶400），放入細胞培養箱孵育16～20h。次日，吸出一抗，預冷PBS 輕柔清洗細胞3 次，加入Dylight488 標記羊抗兔IgG 抗體（二抗濃度1∶400），室溫孵育1h，預冷PBS 輕柔清洗細胞3 次，在倒置熒光顯微鏡下觀察。細胞純度=熒光染色陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.4.3 細胞存活率檢測 利用臺盼藍染色法評價細胞存活率，是目前常規的檢測方法。留取200μl 細胞懸液，加入等量0.4%臺盼藍染液，室溫染色2～ 3min。將染色后的細胞懸液涂于載玻片上，蓋玻片封片，于倒置相差光學顯微鏡下觀察。任意選取5個視野，統計被染色細胞（死細胞）和未被染色細胞（活細胞）。細胞存活率（%）=未被染色細胞/（被染色細胞+未被染色細胞）×100%。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察及細胞純度檢測

2.1.1 光學顯微鏡 細胞培養24h 后，心肌細胞基本全部貼壁，伸出偽足，呈梭形、三角形或不規則形，核仁清楚（圖1A）。培養48h 后，細胞偽足逐漸增多，呈局部片狀。培養72h 后，大部分心肌細胞的突起相互交聯，形成片狀（圖1B）。

圖1 乳小鼠原代培養的心肌細胞圖

2.1.2 細胞免疫熒光染色 培養24h 和培養72h 后，通過免疫熒光染色檢測貼壁心肌細胞，細胞呈梭形、三角形或不規則形。培養24h 后，細胞呈簇狀或團狀分布（圖2A）；培養72h 后，細胞已相互連接，形成片狀（圖2B）。隨機選取5 個不同鏡下視野計算出心肌細胞純度為（95.30±1.36）%。

圖2 乳小鼠原代培養的心肌細胞熒光染色圖

2.2 細胞搏動頻率在倒置顯微鏡下觀察，細胞培養24h 后有少數自發性搏動；培養48h 后出現局部片狀搏動，節律、頻率不等，收縮頻率為（99.33±5.13）次/min；培養第5 天，大部分心肌細胞呈同步收縮，收縮頻率為（100.67±6.43）次/min；培養第7 天、第9 天、第11 天，細胞仍保持均一搏動，收縮頻率分別為（104±10）次/min、（92.67±10.02）次/min、（97.00±9.17）次/min（圖3）。

2.3 細胞存活率通過臺盼藍染色法我們檢測出在培養第2 天、第5 天、第7 天、第9 天、第11 天的細胞存活率分別為（95.33±2.51）%、（83.00±3.60）%、（63.33±3.51）%、（57.67±3.06）%、（48.67±3.21）%（圖4）。

圖3 乳小鼠原代培養心肌細胞搏動頻率

圖4 乳小鼠原代培養心肌細胞存活率

3 討論

心血管疾病的基礎研究技術歷經50年的發展，現今的電生理、鈣瞬變、蛋白質組學及基因水平轉移等研究，對探索心肌細胞病理生理狀態的功能改變起到至關重要的推進作用[7]。心肌細胞的分離與培養則是深入研究心血管疾病最基礎的手段[2]。體外培養的心肌細胞去除了體內復雜的體液、神經等因素的作用，尤其相較于心肌細胞株H9C2 更能有效反映心臟生理特性、信號傳導通路及基因表達等，是研究心血管生理、病理、毒理的常用細胞模型[4]。心肌細胞對物理、化學等損傷極為敏感，這將導致體外分離培養的心肌細胞產量和存活率低等問題。此外，心肌細胞占心臟組織的25%，其余心臟成分以成纖維細胞為主[8]，成纖維細胞分裂增殖能力強，更能成為體外培養的優勢細胞。因此，為了在體外培養出純度高、活性強的心肌細胞，我們根據實驗研究經驗，在傳統的實驗技術方法上進行 改良。

在小鼠年齡選擇上，傳統的心肌細胞培養選用出生3 天的乳鼠[5]，認為此時的心肌細胞增殖更快，但是由于出生時間短的小鼠心臟組織中膠原組織含量少，細胞消化過程省時省力，并且能減少對心肌細胞的損害，因此，我們選用出生24h 內的小鼠進行實驗。在實驗操作的時間節點選擇上，傳統的實驗方法是差速貼壁1 次，時間為1.5h[2，8]，但是我們發現，在第1 次差速貼壁后的上清液中仍有大量成纖維細胞，由于心肌細胞的貼壁時間為4～24h，因此，我們將第1 次差速貼壁后收集的上清液進行第二次差速貼壁，時間為1h。在培養細胞接種密度上，細胞接種密度對細胞正常生長也同樣重要，細胞過密導致營養不良，細胞過疏也將降低細胞間信號傳遞，由于大多數實驗室暫無標準化的細胞接種密度，我們根據William 等[9]的研究，推薦使用1.5×105/10cm2的細胞密度進行接種。我們所分離培養的心肌細胞在搏動節律上一致，搏動頻率在培養第2～11天無明顯差異。通過以上三點的改進，我們在體外分離培養的心肌細胞存活率在培養第2 天達（95.33±2.51）%，在培養第11 天達（48.67±3.21）%，是前面的研究所沒有觀察到的[8，10]。

綜上所述，我們在短時間內體外分離培養獲得純度高、存活率高、生長狀態良好的成片狀的原代心肌細胞，有利于今后為心血管疾病的基礎研究提供參考。