黃連素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥性的體外逆轉作用

李永偉 許曉娜 劉心偉 張小倩 王志盛 趙芝靜 王春霞

我們前期研究發現產KPC 酶是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的最主要耐藥機制[1]，目前發現的KPC 酶有KPC1～19 共19 種，其中KPC-1 和KPC-2 完全相同，故KPC-1 名稱不再使用，其中在我國最為常見的是KPC-2，編碼KPC 的基因多位于Tn1721 的Tn3 型轉座子上，有的位于染色體或者質粒上，可以在革蘭陰性同屬和不同屬細菌之間進行垂直或水平傳播，從而導致耐藥性的廣泛播散。在傳播過程中，質粒作為載體起著重要作用，質粒是細菌除染色體外獨立遺傳物質，存在于細胞質中，常為閉合環狀的雙鏈DNA，能夠自主復制，根據其傳播耐藥性的方式，分為可在細菌間進行接合轉移的R 質粒，以及只能通過噬菌體轉導傳播的R質粒，在革蘭陰性菌中，以R 質粒多見，常能傳播數種抗菌藥物的耐藥性。

黃連素有很好的抗菌活性，對臨床分離的CRKP具有一定的抑菌作用，但其具體作用機制尚不清楚，對黃連素是否能夠消除CRKP 攜帶耐藥的R 質粒，從而恢復其對常用抗菌藥物敏感性的相關研究較少。本研究選擇我院臨床微生物室2014年1月～2017年8月分離的82 株CRKP 中耐藥基因為KPC 且測序完整菌株19 株進行進一步的質粒接合轉移試驗，探討接合性R 質粒的存在，并將黃連素作為質粒消除劑進行質粒消除實驗，觀察作用效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株選擇我院臨床微生物室2014年1月～2017年8月分離的82 株CRKP 中耐藥基因為KPC且經測序確認的19 株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌作為實驗菌株，選取20 株碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌菌株作為對照，實驗菌株做質粒接合轉移實驗，受體菌為對疊氮鈉耐藥的J53 大腸埃希氏菌（E.coli J53），由浙江大學附屬兒童醫院周明明老師惠贈。

1.2 主要設備及耗材渦旋混合器（德國Thermo）、Precisa XT220A 分析天平（瑞士Precisa）、NS-100B搖床（上海皓莊）、高壓滅菌鍋（YXQ-LS-100SII，上海博迅）、黃連素注射液（山西芮添）、MH 瓊脂（英國Oxoid）、MH 肉湯（英國Oxoid）、酵母提取物（英國Oxoid）、十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS，華美生物）、美羅培南標準品（100mg/支，中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 黃連素對肺炎克雷伯菌臨床分離株的MIC 測定按照《全國臨床檢驗操作規程》（第4 版）[2]推薦的微量肉湯稀釋法進行以下實驗：①取7 個滅菌玻璃試管，做好標記，在第1～6 管中各加入1ml 之前配制好的MH 肉湯，第7 管加入2ml MH 肉湯作為陰性對照；②吸取1ml 10mg/ml 的黃連素原液緩慢加入第1 管，用移液器槍頭小心吹打混勻，然后從第1管中吸取1ml 溶液加入第2 管，再次小心吹打混勻，從第2 管中吸取1ml 溶液加入第3 管，以此類推直至第5 管，第5 管內的2ml 混合液吹打混勻后棄去1ml，第6 和第7 管中不添加藥物，第1～5 管中的中藥終濃度依次為5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/ml；③挑取適量隔夜培養的CRKP 純菌落，加入NaCl 濃度為0.45%上機專用生理鹽水配制0.5 麥氏濁度的菌懸液，再加入MH 肉湯進行100 倍稀釋，最后吸取1ml 稀釋過的菌懸液加入上述第1～6 管中，加蓋滅菌試管塞，在CO2培養箱中37℃孵育24h，孵育結束后用接種環轉種至哥倫比亞血平板，過夜培養，在經過倍比稀釋后，仍然無細菌生長的中藥濃度作為其MIC。

1.4 質粒接合轉移試驗①供體菌和受體菌活化和再活化：以KPC 陽性的CRKP 為供體菌，臨床分離全敏感高毒力肺炎克雷伯菌（Kpn）為受體菌；選取40ml 經過高壓滅菌的三角小燒杯，提前加入10ml LB 肉湯，在哥倫比亞血平板上挑取上述菌株單個菌落，加入小燒杯，用無菌紗布密封后放入搖床，設定恒溫37℃，轉速設定為120r/min，活化14h；培養結束后取100μl 上述培養物和10ml LB 肉湯混勻（稀釋比例1∶100），放入搖床37℃，120r/min 繼續培養4h 進行再活化。②供受體菌接合及接合子篩選：質粒接合轉移試驗的具體程序參照劉心偉等[3]方法，取上述活化后供受體菌按照4∶1（0.1ml CRKP，0.4ml 高毒力Kpn）的比例加入含有10ml LB 肉湯的滅菌三角小燒瓶中，無菌紗布密封，放置37℃隔水恒溫培養箱中，培養12h；使用之前配制好的中國藍選擇培養基（含2μg/ml 的MEM）作為接合子篩選平板，此平板CRKP 和接合子均可生長，但所選CRKP 為粗糙型菌落，接合子為飽滿光滑型菌落，從形態上可將兩者區分，如果僅有粗糙型菌落生長，則視為實驗失敗。吸取20μl 的接合混合物稀釋10 倍后接種至含藥的中國藍篩選平板上，37℃恒溫培養24h，觀察有無菌落生長，并對接合子常規鑒定，用E-test 法測得其對IPM 的MIC。

1.5 黃連素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌R 質粒的體外消除試驗參照劉心偉等[3]的質粒消除實驗進行，選取1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）作為陽性對照。

1.5.1 菌懸液配制 取15ml 無菌試管，加入5ml LB肉湯，挑取質粒接合轉移試驗陽性的6 株CRKP 單個菌落，于恒溫搖床中35℃，120r/min，隔夜增菌培養，再活化4h 后，用上機專用生理鹽水配制3.0 麥氏濁度菌懸液（細菌濃度約為9×108個/ml）。

1.5.2 消除試驗 第1～5 管用LB 肉湯與黃連素倍比稀釋不同濃度，第6 管加入1%SDS，第7 管加LB肉湯，第6、7 管作為陽性對照，第8 管只加LB 肉湯作為陰性對照，第1～7 管加入菌懸液共同培養24、48、72h，然后用移液器從第1～8 管中吸取10μl，分三區劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板，培養24h 后，挑取單個菌落約300 個進行平板影印培養，連續影印至普通中國藍平板和含MEM 2μg/ml 的篩選中國藍平板，消除子在不含藥物的中國藍培養基能夠生長，而在含藥物的中國藍培養基不能生長，計數300 個菌落中消除子的數量，并以消除子數量/300 ×100%計算消除率。

1.6 統計學方法應用SPSS 17.0 統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KPC 陽性CRKP 菌株質粒接合轉移試驗結果19 株KPC 基因型陽性的CRKP 菌株，其中6 株質粒接合轉移試驗陽性，占31.58%（6/19）。

2.2 藥敏試驗結果黃連素對肺炎克雷伯菌的MIC 為0.625～2.5mg/ml，其對不同耐藥程度肺炎克雷伯菌的藥物敏感性差異無統計學意義（t=1.89，P=0.07），見表1。

表1 黃連素對Kpn 的藥物敏感性試驗結果（±s）

Kpn 菌株 Kpn 表型 菌株數（n） MIC（mg/ml）敏感菌株 IPM（S） 20 1.00±0.59耐藥菌株 IPM（R），KPC（+） 19 1.38±0.72

2.3 黃連素對KPC 陽性CRKP 的R 質粒消除試驗結果黃連素對6 株試驗菌株在24、48 和72h 的R質粒消除率分別為0、3.1%和4.7%；1%SDS 在24h、48h 和72h 的R 質粒消除率分別為1.1%、4.0%和8.1%；空白對照所有時間段質粒消除率均為0，從而排除質粒在復制中自行丟失的可能性。見表2、3。

表2 黃連素對KPC 陽性CRKP 菌株的R 質粒消除率（%）

表3 1%SDS 對KPC 陽性CRKP 菌株的R 質粒消除率（%）

3 討論

典型肺炎克雷伯菌為革蘭染色陰性，菌體粗短，兩端較平。鏡下呈現單個、成對或者短鏈狀。細胞外有莢膜多糖，在宿主體內因為營養豐富莢膜尤為明顯，無芽孢及鞭毛，多數有菌毛。肺炎克雷伯菌抵御外界能力強，對抗菌藥物容易產生耐藥性，具有O 和K 兩種抗原，分別屬3 型和12 型。55℃時，30min 即能使細菌滅活，在培養基上可存活數月。其營養類型為兼性厭氧，營養要求低，在普通培養基上即能形成較大的灰白色粘液菌落。該細菌能耐受膽鹽環境，在含膽鹽的選擇性培養基上生長，培養24h 形成大菌落，48h 易融合成片，形成膠水樣菌苔。少數肺炎克雷伯菌可生長為粗糙型菌落。在血瓊脂平板上無溶血和特殊氣味產生。在腸道桿菌選擇性培養基上因為可發酵乳糖，從而呈現有色菌落。肺炎克雷伯菌細菌氧化酶陰性，觸酶陽性，大多數菌株可利用枸櫞酸鹽，多數菌種的尿素酶陽性或者遲緩陽性；V-P 試驗陽性；發酵葡萄糖產酸產氣，均能發酵側金盞花醇；ONPG 均為陽性。不產生硫化氫，也不產生苯丙氨酸脫氨酶及DNA 酶。可利用肌醇、鼠李糖及蔗糖作為唯一碳源，也可利用乳糖和山梨醇。不水解葡萄糖醛酸苷，不產生色氨酸脫氨酶及組氨酸脫氨酶。

肺炎克雷伯菌可定植在人體胃腸道以及鼻咽部，常引發多部位感染。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥率較高，相關文獻報道CRKP 引發敗血癥的病死率可高達48%[4]。由于廣譜抗菌藥物的不合理應用，耐藥菌株比例不斷增加，臨床治療效果差[5]。

近年來，中藥抗感染成為研究熱點，傳統中藥抗菌效果好，副作用小，且價格低廉，不易產生耐藥性，深受研究者青睞，在閱讀大量相關文獻后，本研究選取黃連素作為試驗藥物。黃連素根據提取物不同可分為硫酸小檗堿和鹽酸小檗堿，為黃連的主要成分，分子量為336，屬于異喹啉類生物堿，其價格低廉、容易取得、抗菌譜廣[6]。中國藥典記載黃連能夠抗菌消炎，有文獻報道它能夠作用于大腸埃希菌的多個位點，并且不產生誘導抗藥[7]。研究表明黃連素能夠消除質粒、抑制細菌RNA、抑制蛋白質以及脂質的生物合成和糖酵解，阻止細菌細胞壁粘肽的合成，甚至直接破壞細菌超微結構[8]。另外還能夠調節機體的免疫系統以及改善機體微循環，從而清除病原菌[9]。國內也有學者對其進行體外抑菌試驗，證明黃連素對多種常見細菌均具有一定的抑制作用，并且對肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌的抗菌作用甚至優于青霉素，若黃連素與其他抗菌藥物聯合應用效果更好[10]。本研究顯示，黃連素對肺炎克雷伯菌具有良好的抗菌效果，MIC 值為0.625～2.5mg/ml，黃連素對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌的抗菌作用無差異，目前黃連素在臨床多應用于腸道菌群的感染，本研究結果提示可以擴大黃連素應用范圍，輔助抗菌藥物抗菌，可取得良好的抗菌效果，因為抗菌機制本身具有復雜性，不止一個作用位點，因此不易產生耐藥性。

傳統中藥逆轉細菌耐藥性的途徑[11～13]：①消除耐藥R 質粒；②抑制主動外排系統；③抑制ESBLs的產生；④抑制耐藥基因的表達，其中消除耐藥R質粒為主要途徑。本研究中，采用不同濃度黃連素作為質粒消除劑，1%SDS 作為陽性對照，另外設置空白對照以排除質粒在傳代中自行丟失的情況，作用時間段設定為24、48、72h，通過影印方法計算消除率。雖然黃連素的消除率低于1%SDS，但由于SDS 為化學制劑，是一種能刺激皮膚的表面活性劑，只能用于試驗，不能應用于臨床，黃連素則是清熱燥濕、瀉火解毒的常用中藥，其對CRKP 中R 質粒有消除作用，能逆轉CRKP 耐藥性，提高其對抗菌藥物的敏感性，降低耐藥率，為中藥抗感染治療提供了實驗數據。但對不同耐藥菌株攜帶的耐藥基因尚未全面研究和評估，這也為后續進一步研究提供了思路。