局部應用普伐他汀干預激素性股骨頭壞死的組織學觀察

梁紅鎖 李林 梁輝

激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）是一種常見的骨科難治性疾病，好發于青壯年，如未進行有效干預則難以自愈，而且隨著病情進展，患髖疼痛進一步加劇，逐漸出現髖關節功能障礙，最終股骨頭塌陷、變扁，引發骨關節炎，嚴重影響患者的生活和工作。因此早期發現并予以及時、有效的治療是SONFH 診治的基本原則。目前臨床上藥物治療早期SONFH 以抗凝、擴張血管、二磷酸鹽、降脂類藥物為主[1，2]。近年來發現他汀類藥物除具有傳統的降脂作用外，其他作用如抗骨質疏松、促骨形成等使其成為近年來骨科新的研究方向[3，4]。現已有口服他汀類藥物可有效治療SONFH 的實驗研究[5～7]，但尚未見其局部應用干預SONFH 的相關報道。本實驗通過在激素性壞死股骨頭內局部應用普伐他汀，以觀察其促進骨壞死修復的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物45 只成年健康SPF 級新西蘭白兔，體重（2.5±0.5）kg，雌雄不限，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。所有動物均處一室，分籠標準飼料喂養，自由攝食飲水，通風良好，溫度控制在22℃～ 26℃，濕度50%左右，適應性喂養2 周后造模。

1.2 造模方法所有動物于造模前再次稱重，參照秦嶺等[8]造模方法，經兔耳緣靜脈注射10μg/kg 的內毒素（lippolysaccharide，LPS，美國Sigma 公司），并于24h 后進行甲強龍（methylprednisolone，MPS，美國輝瑞制藥公司）臀部肌肉注射，劑量為20mg/kg。MPS 每次間隔24h 臀部肌肉注射，共3 次。造模6周后，將動物以隨機數字表法分為3 組，每組15 只。A 組（模型組）：自由進食，未實施其他干預措施。B組（髓芯減壓組）：雙側股骨頭予以髓芯減壓，并于減壓通道內植入無菌明膠海綿。C 組（普伐他汀局部用藥組）：雙側股骨頭髓芯減壓后，于減壓通道內植入含10mg 普伐他汀的無菌明膠海綿（其中普伐他汀予以鈷60 輻照滅菌）。兔髓芯減壓方法參照本課題組前期研究[9]。分別于股骨頭髓芯減壓術后第4、8、12 周，每組各處死5 只白兔，取其左側股骨頭標本進行病理學研究，右側行相關分子生物學檢測（另文發表）。

1.3 病理學觀察

1.3.1 大體觀察 將兔股骨頭從冠狀面正中剖開，主要觀察股骨頭的顏色、外形、軟骨厚度、骨髓腔各組織成分的改變、骨小梁密度等。

1.3.2 HE 染色 股骨頭以10%甲醛溶液固定24h后，5%硝酸脫鈣，系列梯度酒精脫水，石蠟包埋后進行切片，厚度為5μm。HE 染色，顯微鏡下觀察軟骨、軟骨下骨、骨髓腔內骨細胞、脂肪細胞及骨小梁等結構。光鏡下任選5 個高倍視野，每個視野計數20～30 個骨細胞，計算空骨陷窩率，取其平均值作為該股骨頭的空骨陷窩率。

1.4 統計學方法采用SPSS 17.0 軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察A 組：術后第4 周，股骨頭外形正常，軟骨面為暗紅色，股骨頭切面內骨皮質變薄，髓腔內可見無定形壞死骨組織，有較多脂肪組織沉積。術后第8 周，股骨頭骨質較松脆，易于剖切，髓腔內壞死面積增大，脂肪組織較前增多。術后第12 周，股骨頭外形正常，股骨頭內壞死面積較前稍減小，壞死組織周圍有少量新骨形成。B 組：術后第4 周，股骨頭外形正常，軟骨面顏色稍暗，略呈灰白色，股骨頭骨皮質變薄，髓腔內可見壞死骨組織，伴少量脂肪組織增生。術后第8 周，股骨頭內壞死面積稍增大，脂肪組織較前增多。術后第12 周，股骨頭外形正常，骨壞死面積較前減小，壞死骨組織周圍有較多新骨形成。C 組：術后第4 周，股骨頭外形正常，軟骨面顏色略暗，稍呈灰白色。股骨頭骨皮質變薄，髓腔內可見骨壞死，伴少量脂肪組織增生。術后第8 周，軟骨面呈淡紅色，股骨頭內壞死面積較前減小，有少量新生骨組織形成。術后第12 周，股骨頭外形正常，股骨頭內壞死面積較前明顯減少，壞死組織周圍有大量新骨形成。

2.2 光鏡觀察A 組：術后第4 周，股骨頭內有大量脂肪細胞增生，骨小梁變細、排列稀疏，骨細胞核邊聚，空骨陷窩數較多。術后第8 周，股骨頭骨髓腔內壞死區結構紊亂，部分纖維肉芽組織形成，骨小梁斷裂、稀疏，骨細胞核邊聚明顯，空骨陷窩進一步增多。術后第12 周，壞死股骨頭內骨小梁周圍可見少量新生骨組織，空骨陷窩數稍減少（見圖1A）。B 組：術后第4 周，股骨頭內有較多壞死組織，大量脂肪細胞增生，骨小梁排列稀疏，骨細胞核邊聚較明顯，有較多空骨陷窩。術后第8 周，股骨頭骨髓腔內壞死區結構紊亂，部分骨小梁斷裂，空骨陷窩增多。術后第12 周，斷裂骨小梁周圍可見少量新生骨組織形成，空骨陷窩數較前減少（見圖1B）。C組：術后第4 周，股骨頭內有中等量脂肪細胞增生，骨小梁稍稀疏，部分骨小梁斷裂，可見較多空骨陷窩。術后第8 周，股骨頭內有少量脂肪細胞，骨小梁周圍有較多新生骨組織及血管形成，空骨陷窩減少。術后第12 周，骨小梁密度基本正常，偶見空骨陷窩（見圖1C）。

圖1 各組術后第12 周光鏡觀察（HE，200×）

2.3 各組造模后空骨陷窩率比較B、C 兩組空骨陷窩率均較A 組低（P＜0.05）。C 組空骨陷窩率低于B組（P＜0.05），見表1。

表1 各組術后第4、8、12 周空骨陷窩率比較（%，±s，n=5）

表1 各組術后第4、8、12 周空骨陷窩率比較（%，±s，n=5）

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，△P＜0.05

分組 第4 周 第8 周 第12 周A 組 30.29±3.83 32.85±2.32 26.71±2.43 B 組 23.14±2.65* 27.09±1.93* 19.87±1.99*C 組 16.23±1.94*△ 13.83±1.17*△ 10.58±1.87*△

3 討論

研究表明激素可促使骨細胞凋亡，導致股骨頭單位體積內骨細胞數量下降[10]。長期應用激素導致股骨頭內骨小梁數目減少，引起骨質疏松，骨組織機械應力隨之減弱，在輕微的外力作用下即可發生骨小梁微細骨折[11]。與此同時，由于激素可引起骨內微循環障礙、誘導骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向脂肪細胞分化等多種因素，應力引發的軟骨下微骨折得不到及時修復，最終出現股骨頭骨壞死、塌陷。核心結合因子（core binding factor a1，Cbfa1）是成骨細胞分化過程中的特異性轉錄因子，BMP-2 可促進BMSCs 向成骨細胞分化[12]。有研究表明，普伐他汀灌胃能上調兔激素性壞死股骨頭內Cbfa1 及BMP-2 mRNA 的表達，且隨著治療時間延長，二者的表達水平逐步升高[13]。胡敏等[14]研究發現，與兔SONFH 模型組的股骨頭髓腔內大量脂肪細胞增生及壞死骨組織相比，普伐他汀灌胃治療組內骨細胞受損程度較輕，空骨陷窩數較少，脂肪細胞數量減少及骨壞死面積均明顯減小，表明普伐他汀口服可有效促進激素性壞死股骨頭的修復。

目前在他汀類藥物促骨形成的動物實驗中，多采用口服給藥。他汀類藥物口服后經過肝臟的首過效應，進入血液循環的藥物濃度不足5%，進入骨組織的藥物濃度則更低[15]。由于口服給藥往往療程較長，患者的依從性會受到較大影響。通過改變此類藥物的給藥途徑來提高其生物利用度值得探究。劉屹嵩等[16]將兔下頜骨骨折區覆蓋含辛伐他汀的明膠海綿作為實驗組，與單純覆蓋明膠海綿的對照組相比，實驗組在術后第2、4 周的BMP-2 陽性表達率明顯高于對照組，骨痂形成與改建速度優于對照組。李楊等[17]將辛伐他汀局部注入去勢大鼠的股骨髓腔，給藥1 個月后，辛伐他汀治療組的骨皮質厚度、骨小梁密度等明顯優于對照組，表明辛伐他汀局部應用可促進骨小梁改建、強化局部骨質。本課題組前期研究發現，普伐他汀局部應用可上調兔激素性壞死股骨頭內BMP-2 mRNA 的表達[18]。

本實驗結果表明，壞死股骨頭內局部應用普伐他汀后有明顯新生骨組織形成，骨小梁密度基本恢復正常，單位面積內空骨陷窩率降低，與同期其他兩組比較，差異有統計學意義，表明普伐他汀局部用藥可促進激素性壞死股骨頭的修復，有望為SONFH 的臨床治療提供一種新的方法。