牛磺酸調節白介素水平對椎間盤退變大鼠模型髓核細胞凋亡、炎癥和氧化應激的保護作用

史 銳 朱振軍 楊永波 (新鄉中心醫院骨科，新鄉 453000)

隨著人口老齡化不斷加重，下腰痛已成為很普遍的健康隱患，給患者家庭和社會造成了沉重的負擔[1]。椎間盤是機體完成脊柱運動、負重和柔韌性能的基礎，但易受損傷而發生形態學改變，包括年齡、損傷等因素[2]，椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是臨床引起下腰痛的主要原因，其治療包括保守治療、椎間盤切除和脊柱融合，但均不能從根本上阻止其退變[3,4]。研究表明，炎癥微環境和新的神經支配產生是椎間盤性疼痛的來源，包括IL-1β在內的許多炎癥因子分泌增加都會促進椎間盤退變；同時，IL-1β還能影響椎間盤細胞衰老、自噬和與增殖、再生有關的基因表達[5,6]。因此，抑制IL-1β可能是預防和逆轉椎間盤退變的重要治療靶點。牛磺酸(taurine)，又名2-氨基-乙磺酸，因首次分離自牛的膽汁而得名，大量研究表明，牛磺酸是具有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡和神經保護功能的游離的細胞內β氨基酸[7-9]。但關于牛磺酸對髓核細胞炎癥、凋亡和氧化應激的影響鮮少報道，基于此本文采用原代培養的大鼠髓核細胞，以IL-1β誘導建立椎間盤退變大鼠髓核細胞模型，探究牛磺酸對椎間盤退變大鼠髓核細胞模型細胞凋亡、炎癥和氧化應激的作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠購自維通利華公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Biosharp公司；Hochest33342凋亡檢測試劑盒(Solarbio 公司)；DMEM/F12培養液，青霉素、鏈霉素雙抗，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；IL-1β、牛磺酸購自Sigma公司；總RNA 提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；胎牛血清購自Hyclone公司；甲苯胺藍試劑盒購自Baso公司；番紅O試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；RT-PCR試劑購自TransGen公司；倒置相差顯微鏡購自 Nikon公司；6 孔培養板、24 孔培養板購自Corning公司；凈化工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；CO2細胞培養箱、凝膠自動成像系統購自SIM公司；高速冷凍離心機購自美國Eppendorf公司；Caspase-3、Caspase-9、GAPDH引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；隔水式恒溫孵育箱、電子天平、全自動酶標洗板機、酶標儀、恒溫振蕩器及普通手術器械等購自上海知信實驗儀器技術有限公司。

1.2方法

1.2.1髓核細胞分離培養[10,11]健康成年SD大鼠5只，體重(200±20)g，采用CO2麻醉致死法處死大鼠。將其放入75%酒精浸泡對體表進行消毒，再移入凈化工作臺內，在無菌條件下分離胸腰段脊柱，再仔細剝離脊柱周圍多余的肌肉組織，使椎間盤充分暴露，最后小心劃開纖維環獲取白色凝膠樣髓核組織。將獲得的組織用PBS液反復洗滌，以去除破碎的其他組織及血漬，再將其切成約1 mm3的小碎塊，移入滅菌離心管中，用0.1% Ⅱ 型膠原酶將其淹沒。在37℃恒溫振蕩器中振蕩消化0.5 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS液離心漂洗3次，棄離心液備用。再用0.1% Ⅱ 型膠原酶重懸離心后的組織塊，在37℃、5%CO2條件下孵育4 h，最后將上述細胞懸液用 70 μm孔徑的細胞篩網過濾。將得到的細胞用DMEM/F-12離心洗滌3次，轉入25 cm2細胞培養瓶中，加入含1%青-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。4～5 d 后首次換液，去除漂浮組織塊，以后每3 d換液一次，當細胞融合率達到85%時可進行傳代。倒置相差顯微鏡觀察每代細胞形態，第2代細胞用于細胞鑒定，第3代細胞進行后續實驗。

1.2.2細胞鑒定及形態學觀察 采用番紅染色和甲苯胺藍染色鑒定髓核細胞。將第2 代細胞接種于24 孔板，細胞貼壁后去除原培養液，用PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定細胞30 min，后用PBS漂洗5 min×3次，1%甲苯胺藍染色10 min，0.5%番紅O染液滴染1 min，雙蒸水洗滌1 min，鏡下觀察細胞。

1.2.3椎間盤退變大鼠髓核細胞模型建立及給藥 將第3代髓核細胞接種于6孔培養板中，將細胞隨機分為5組，Ctrl組(空白對照組)、IL-1β組(10 ng/ml)、IL-1β+Taurine組(100 μg/ml)、IL-1β+Taurine組(200 μg/ml)和IL-1β+Taurine組(400 μg/ml)，將各組細胞培養24 h 后進行后續實驗。

1.2.4Hochest33342染色檢測髓核細胞凋亡率 將上述各組細胞用PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定細胞30 min，去除固定液，PBS漂洗3次，加入Hochest33342 1 ml染色15 min，去除染色液，PBS漂洗3次，鏡下觀察、拍照。

1.2.5蛋白印跡檢測Caspase-3、Caspase-9的表達 將1.2.3所述細胞用RIPA蛋白裂解液于冰上提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度并調平。每組取等量蛋白質用12%SDS-PAGE分離蛋白后，轉移蛋白質到PVDF膜。室溫封閉蛋白質 2 h，以1∶1 000的濃度加入Caspase-3、Caspase-9一抗，4℃孵育過夜。第二天棄去一抗，用緩沖液清洗PVDF膜后，加入二抗，室溫封閉1 h后，滴加ECL于暗室曝光顯影。以GAPDH為內參。

1.2.6檢測細胞氧化應激因子SOD、 MDA、GSH和LDH的含量 按照說明書操作，檢測1.2.3所述各組髓核細胞內氧化應激因子SOD、 MDA、GSH和LDH的含量。

1.2.7ELISA檢測細胞炎癥因子IL-6、iNOS、IL-10的表達 按照說明書操作，檢測1.2.3所述各組髓核細胞內炎癥因子IL-6、iNOS、IL-10的表達水平。

1.2.8Western blot檢測NF-κB p65的磷酸化和TNF-α的表達水平 用1.2.4所述方法檢測NF-κB p65、p-p65(即p-p65/p65相對表示水平)、TNF-α的表達，以評價NF-κB p65的磷酸化水平和TNF-α的表達水平。

1.2.9免疫熒光檢測p65的入核情況 將1.2.3所述細胞培養24 h后，用PBS漂洗細胞2遍，4%多聚甲醛固定細胞15 min，去除固定液，PBS漂洗3次，加入1 ml DAPI染液，室溫染色5 min，輕輕吸去染液，PBS漂洗3次，鏡下觀察。

2 結果

2.1髓核細胞的鑒定 本實驗采用Ⅱ型膠原酶分離培養原代髓核細胞，對第2代髓核細胞進行番紅和甲苯胺藍染色對細胞進行鑒定。結果表明：如圖1所示，經番紅染色可見細胞質和細胞核均被染成棕黃色；而經甲苯胺藍染色可見細胞質被染成天藍色，且靠細胞核越近染色越深；當兩者染色后均可見細胞呈現三角形或多邊形的“鋪路石”樣，細胞形態符合軟骨細胞形態特點，因髓核細胞是特殊類型的軟骨細胞，故可說明髓核細胞分離成功。

2.2牛磺酸對IL-1β誘導的髓核細胞凋亡率及Caspase-3、Caspase-9表達的影響 用Hochest33342對各組細胞進行凋亡率檢測，結果如圖2A、B所示：與Ctrl組相比，IL-1β組細胞核固縮、染色加深明顯，細胞凋亡率顯著上調(P<0.01)；經牛磺酸處理后，各模型加藥組細胞核固縮、染色加深程度降低，細胞凋亡率較IL-1β組均下調(P<0.01)，且這種下調作用隨牛磺酸濃度的增加而增強。另外，蛋白印跡實驗顯示，如圖2C所示：與Ctrl組相比，IL-1β組Caspase-3、9的相對蛋白表達水平均顯著上調(P<0.01)；而經牛磺酸處理后，隨牛磺酸濃度的增大Caspase-3、9的相對蛋白表達水平較Ctrl組均明顯下調(P<0.01)。

綜上所述，IL-1β能誘導髓核細胞發生凋亡，上調凋亡相關蛋白Caspase-3、-9的表達，而牛磺酸可以負向調節其對髓核細胞凋亡和凋亡相關蛋白Caspase-3、-9表達的上調作用。

2.3牛磺酸對IL-1β誘導的髓核細胞氧化應激因子SOD、 MDA、GSH和LDH含量的影響 檢測各組細胞中氧化應激因子的含量，結果如圖3所示：與Ctrl組相比，IL-1β組細胞SOD、GSH含量顯著降低(P<0.01)，MDA、LDH含量顯著升高(P<0.01)；經不同濃度牛磺酸作用后，各模型加藥組細胞SOD、GSH含量較IL-1β組呈牛磺酸劑量依賴性的升高，同時MDA、LDH含量隨牛磺酸濃度增加而降低(P<0.01)。說明，IL-1β能誘導髓核細胞產生MDA、LDH，降解SOD、GSH，而牛磺酸可以劑量依賴性地減弱IL-1β對上述氧化應激因子的作用。

圖1 番紅染色和甲苯胺藍染色鑒定髓核細胞Fig.1 Nucleus pulposus cells were identified by safranin O staining and toluidine blue staining

圖2 牛磺酸對IL-1β誘導的髓核細胞凋亡率和凋亡相關因子表達的影響Fig.2 Effects of taurine on apoptosis rate of NP cells induced by IL-1β and expression of apoptosis related factorsNote:A.Apoptosis detected by Hochest33342；B.Statistical analysis of apoptosis rate in NP cells；C.Western blot analysis demonstrating the effect of taurine on the Caspase-3，9 protein expression levels and the statistical analysis of them.**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

圖3 牛磺酸對髓核細胞氧化應激因子含量的影響Fig.3 Effects of taurine on content of oxidative stress factors in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

圖4 牛磺酸對髓核細胞炎癥因子表達水平的影響Fig.4 Effect of taurine on protein level of inflammatory factors in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

2.4牛磺酸對IL-1β誘導的髓核細胞炎癥因子IL-6、iNOS、IL-10表達水平的影響 采用ELISA方法檢測各組細胞中炎癥因子的表達水平，結果如圖4所示：與Ctrl組相比，IL-1β組細胞IL-6、iNOS表達被顯著上調(P<0.01)，而IL-10表達呈現明顯下調趨勢(P<0.01)；當用不同濃度牛磺酸作用后，各模型加藥組細胞IL-6、iNOS表達水平較IL-1β組呈牛磺酸劑量依賴性的降低，同時IL-10的表達隨牛磺酸濃度增加而明顯上調(P<0.01)。說明，IL-1β能誘導髓核細胞分泌炎癥因子IL-6、iNOS，同時促進IL-10的降解，而牛磺酸可以劑量依賴性地減弱IL-1β對上述炎癥因子的調節作用。

圖5 牛磺酸對NF-κB p65磷酸化、TNF-α表達和p65入核的影響Fig.5 Effects of taurine on NF-κB p65 phosphorylation,TNF-α expression and p65 entry in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:A.Immunofluorescence method was used to detect the nucleation of p65；B.Statistical analysis of nucleation of p65；C.Western blot analysis demonstrating the effect of taurine on the TNF-α，p-p65 and NF-κB p65 protein expression levels and the statistical analysis of them.**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

2.5牛磺酸對IL-1β誘導的髓核細胞NF-κB p65磷酸化、TNF-α表達和p65入核情況的影響 采用免疫熒光法檢測p65的入核情況，結果如圖5A、B顯示：IL-1β組細胞核內熒光量較Ctrl組明顯增加(P<0.01)；而與IL-1β組相比，各模型加藥組細胞核內熒光量明顯減少(P<0.01)，且隨著牛磺酸濃度的增加，熒光量逐漸減少。說明，牛磺酸能劑量依賴性減少p65的入核量。

蛋白印跡實驗檢測各組髓核細胞NF-κB p65磷酸化情況，以及TNF-α表達水平，結果如圖5C所示：與Ctrl組相比，IL-1β組p-p65/p65、TNF-α表達水平均顯著上調(P<0.01)；同時，各模型加藥組p-p65/p65、TNF-α表達水平較IL-1β組均呈顯著下降(P<0.01)，且隨牛磺酸濃度的增加下降程度也逐漸增強。說明牛磺酸可以負向調節IL-1β誘導的NF-κB p65磷酸化和TNF-α表達水平。

3 討論

IL-1β是促炎性細胞因子IL-1家族的一員，是參與調節機體免疫應答和炎癥反應的關鍵介質，能加劇慢性疾病和急性組織損傷，包括炎癥性腸病、類風濕性關節炎、各種自身免疫和自身炎癥疾病，IL-1β表達上調能增加椎間盤軟骨終板細胞內相關炎癥因子表達，進而加速椎間盤退變進程[12-17]。本實驗采用Ⅱ型膠原酶法成功分離大鼠髓核細胞，并用10 ng/ml IL-1β處理髓核細胞以建立椎間盤退化細胞模型。

誘導細胞凋亡是多種疾病得以發生發展的機制之一，研究表明牛磺酸具有抑制NMDA誘導的視網膜細胞凋亡的作用[18]。體內研究也證實，在老化和退變的椎間盤中存在氧化應激和氧化產物濃度的增加，前者通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，引起髓核細胞活性下降，過早凋亡和衰老，是椎間盤退變的發病機制之一[19，20]。本實驗以成功培養的第3代大鼠髓核細胞為研究對象，用不同濃度的牛磺酸處理模型加藥組細胞，發現牛磺酸能降低IL-1β誘導的髓核細胞凋亡率。另外，研究表明髓核細胞的凋亡可能與Caspase-3、Bcl-2信號轉導有關[21]。本研究發現，牛磺酸抑制了IL-1β對髓核細胞中凋亡執行蛋白Caspase-3、Caspase-9表達的上調，且其抑制作用與牛磺酸濃度呈正比。綜合實驗結果表明牛磺酸能降低髓核細胞的體外凋亡水平。

正常情況下，活性氧(ROS)的生成和去除應處于動態平衡，當身體處于氧化應激狀態時，細胞內分子氧將集聚增加，脂質過氧化水平升高，最終導致DNA損傷和異常蛋白質表達[22]。Rannou等[23]研究表明炎癥明顯的椎間盤會持續壓迫脊髓或神經根，激活iNOS，產生大量NO，從而增加受損區域的iNOS表達水平。Esposito等[24]也證實，通過抑制IL-1β和iNOS的表達，能有效抑制β淀粉樣蛋白誘導的神經炎癥。而大量研究發現，牛磺酸被認為是一種抗氧化劑，可以抑制肥胖誘導的氧化應激和脂肪細胞的炎癥[25，26]，但其抗氧化性能的細胞機制尚未明確。腹腔注射牛磺酸可減輕黏菌素誘導的腎組織氧化應激和線粒體功能障礙[27]。本文研究表明，牛磺酸能降低髓核細胞內IL-1β誘導產生的氧化應激因子，從而減少氧化應激反應，降低對髓核細胞的傷害。

NF-κB信號通路對炎癥性疾病起著重要作用，在骨關節炎細胞中，可見NF-κB p65磷酸化水平升高，進而增加下游TNF-α等炎癥細胞因子的表達[28]。關于炎癥因子在椎間盤中的作用研究，Wang等[29]研究發現，IL-1β、IL-4和腫瘤壞死因子均參與細胞外基質的合成和分解，在椎間盤細胞凋亡中起重要作用。而通過抑制NF-κB的磷酸化激活，能有效抑制TNF-α、IL-1β等炎癥細胞因子產生，從而改善炎性損傷[30]。本文研究發現IL-1β能促進NF-κB p65磷酸化、TNF-α表達和p65入核，但是這種促進作用可以被牛磺酸劑量依賴性的弱化，從而減輕炎癥反應。

綜上所述，本文采用Ⅱ型膠原酶成功分離大鼠髓核細胞，并用10 ng/ml IL-1β誘導建立椎間盤退變細胞模型，以此作為研究對象初步探討牛磺酸對椎間盤模型大鼠髓核細胞凋亡、炎癥和氧化應激的保護作用，結果說明牛磺酸可以通過抑制Caspase-3、-9表達，降低細胞凋亡率，清除氧化產物自由基，抑制炎癥因子表達，降低NF-κB p65磷酸化水平，減少TNF-α表達和p65入核，實現對椎間盤退變模型大鼠髓核細胞凋亡、炎癥和氧化應激的保護作用。本文的研究旨在為椎間盤退化的治療提供一個新的方向。