白藜蘆醇對(duì)低分化肝癌細(xì)胞Hep3B 增殖凋亡的影響

劉晉芳，徐慧超，高 艷，苗宇船，周儒奎

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中030619）

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率都位居世界前列，其中尤以低分化的肝癌患者死亡率較高［1-3］。近年來(lái)，隨著細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)于肝癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡、免疫逃逸、血管生長(zhǎng)等生物學(xué)表型提出的靶向治療，成為肝癌診斷治療的重點(diǎn)［4-5］。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種非黃酮類的多酚化合物，廣泛存在于虎杖、葡萄等植物中，它可以抗炎、抗氧化、保護(hù)肝臟、減輕藥物和酒精等引起的肝中毒，還具有抗腫瘤的生物活性，并且具有低毒性，可通過(guò)抑制DNA 聚合酶，從根本上降低DNA的合成能力，從而抑制細(xì)胞的增殖［6-7］。因此，它被認(rèn)為是一種非常有效的腫瘤治療藥物。目前關(guān)于Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 的毒性、凋亡、周期、遷徙及侵襲等惡性生物學(xué)表型的影響鮮有報(bào)道。為進(jìn)一步觀察Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 的抗癌作用，本實(shí)驗(yàn)從Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3 增殖能力和凋亡能力的影響展開(kāi)研究，為肝癌治療的新靶向藥物的研發(fā)奠定理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌細(xì)胞株Hep3B 購(gòu)自中國(guó)上海科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心。RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone 公司，雙抗、胎牛血清、CCK-8 試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑、胰酶購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物公司；Res 購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals 公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 mg/mL 鏈霉素雙抗的RPMI 1640，基于恒溫37 ℃、5% CO2、飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株Hep3B，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 細(xì)胞傳代后過(guò)夜，分別用Res（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）處理24 h，后將其消化、吹打并計(jì)數(shù)，鋪于96 孔板中（每孔約2000 個(gè)細(xì)胞），孵育24 h、48 h 和72 h后于各孔中加入10 μL CCK-8 溶液，將96 孔板放入孵箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)吸光度（OD）值，計(jì)算其相應(yīng)的細(xì)胞活力，并計(jì)算出其IC50。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 不同濃度的Res（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）處理細(xì)胞48 h 后，將其消化、吹打、計(jì)數(shù)，PBS 清洗1 次，加入適量無(wú)水乙醇，4 ℃過(guò)夜固定；收集細(xì)胞，PBS 清洗3 次，加入100 μL 的RNase，37 ℃孵育1 h，加入50 μg/mL PI，4 ℃反應(yīng)30 min，300 目濾網(wǎng)過(guò)濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 不同濃度的Res（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）處理細(xì)胞48 h 后，胰酶消化并吹打，使樣品的細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，PBS 清洗2 次，用500 mL 結(jié)合緩沖液懸孵細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混勻，再加入5 μL PI混勻；避光反應(yīng)15 min，1 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Res 抑制肝癌細(xì)胞Hep3B 的增殖

隨著Res 藥物濃度的增加，Hep3B 細(xì)胞增殖抑制率在一定范圍內(nèi)顯著增加，且呈濃度和時(shí)間依賴性（P＜0.05，P＜0.01）。肝癌細(xì)胞Hep3B 在Res 處理48 h 后，其半數(shù)致死濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）約為40 μmol/L，為了進(jìn)一步闡明Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 生物學(xué)表型的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均用Res 處理48 h 進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 增殖能力的影響 （h，±s）

表1 Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 增殖能力的影響 （h，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n 24h 48h 72h空白對(duì)照組 4 0.63±0.05 1.13±0.08 1.38±1.17 Res 組（20 μmol/L） 4 0.35±0.131） 0.82±0.041） 1.02±0.061）Res 組（40 μmol/L） 4 0.18±0.052） 0.54±0.022） 0.82±1.131）Res 組（80 μmol/L） 4 0.07±0.032） 0.18±1.212） 0.39±0.072）

2.2 Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

將肝癌細(xì)胞Hep3B 用不同濃度的Res（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）處理48 h 后，進(jìn)行PI 染色，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA 含量的測(cè)定，根據(jù)DNA 含量的分布情況，用Flow Jo 軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Res 處理后的肝癌細(xì)胞Hep3B 處于G1、S 期的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少，而處于G2/M 期的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著增多（P＜0.05），提示Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 具有周期阻滯效應(yīng)。

將肝癌細(xì)胞Hep3B 用不同濃度的Res 處理48 h 后，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI 試劑盒染色，流式細(xì)胞分析軟件Flow Jo 進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。研究結(jié)果表明Res 處理后的肝癌細(xì)胞Hep3B 與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），提示Res 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞Hep3B 的凋亡。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）

表2 Res 對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P＜0.05

組別 n G1 S G2/M 凋亡率（%）空白對(duì)照組 4 67.45±0.73 23.64±1.16 8.10±1.25 3.25±0.41 Res（20 μmol/L） 4 42.63±0.931） 43.24±0.07 14.13±0.761） 4.34±0.23 Res（40 μmol/L） 4 39.45±1.711） 38.19±0.53 22.36±0.281） 4.87±0.691）Res（80 μmol/L） 4 41.37±0.961） 23.46±1.98 35.17±2.361） 6.89±0.381）

3 討 論

肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、多因素參與的過(guò)程，肝癌患者的臨床療效與腫瘤的分期及分化程度、異型性密切相關(guān)，低分化的肝腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性較強(qiáng)，直接影響患者對(duì)化療和其他治療的應(yīng)答［8-9］。此外超過(guò)2/3 的患者在確診時(shí)已不能經(jīng)手術(shù)切除，因此化療不僅可以用來(lái)緩解不能經(jīng)手術(shù)切除患者的臨床癥狀，而且可以降低術(shù)后患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步探明有效的化療或者抗癌藥物能夠有效預(yù)防和控制癌癥的發(fā)生與發(fā)展［10］。

研究發(fā)現(xiàn)，Res 對(duì)乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、白血病、卵巢癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞均有明顯的抑制作用［11-12］。Res 還具有抗病毒、抗衰老、抗變態(tài)反應(yīng)、保肝等作用，是一種天然的抗腫瘤化學(xué)預(yù)防劑，在腫瘤發(fā)生的起始、增進(jìn)和擴(kuò)展3 個(gè)階段，都具有較好的防癌活性，它可以抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞分化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［13］。還有研究表明Res 可提高機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬率，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答［14-15］。Res 同時(shí)還能抑制蛋白酪氨酸激酶這一催化酪氨酸磷酸化的物質(zhì)，該激酶包含在有絲分裂調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)信息傳導(dǎo)中，利用Res 抑制蛋白酪氨酸激酶，可能是通過(guò)阻止激酶功能而起到抗突變作用的［16-17］。

關(guān)于Res 對(duì)低分化肝癌細(xì)胞Hep3B 增殖凋亡的影響目前鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Res 可抑制低分化肝癌細(xì)胞Hep3B 細(xì)胞的增殖，且對(duì)低分化肝癌細(xì)胞Hep3B 細(xì)胞周期具有阻滯效應(yīng)，并呈濃度依賴性；同時(shí)它還可以促進(jìn)低分化肝癌細(xì)胞Hep3B 細(xì)胞的凋亡，這為肝癌的臨床治療提供了新思路與新方向。然而本研究只探討了Res 對(duì)低分化肝癌細(xì)胞Hep3B 增殖凋亡的影響，仍存在諸多不足，包括未涉及Res 干預(yù)低分化肝癌細(xì)胞Hep3B 增殖凋亡的具體作用通路及機(jī)制，未在多種肝癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)行深入探討。