miR-195-5p靶向調控ELMO2抑制IL-17誘導的胃癌細胞AGS侵襲和遷移

鐘 晨 張麗翠 朱美意 (石河子大學醫學院第一附屬醫院普外三科,石河子 832000)

胃癌分子發生機制十分復雜，其與胃癌中異常表達的基因有關，這些基因參與調控胃癌細胞惡性轉移，研究胃癌分子發生機制對于胃癌的治療具有重要意義[1]。IL-17是一種促炎因子，其由多種細胞分泌，在腫瘤進展中發揮關鍵作用[2]。研究顯示，IL-17在腫瘤患者中高表達，IL-17促進腫瘤細胞惡性轉移，IL-17是構成腫瘤微環境的重要組成部分[3]。miRNA與細胞的生長、運動以及組織代謝等有關，是一個多功能非編碼RNA[4]。miRNA還與腫瘤的發生有關，其在腫瘤組織中異常表達往往與腫瘤患者的淋巴結轉移、病理分期等密切相關[5]。miR-195-5p屬于miR-15家族，其在多數腫瘤組織中起到抑癌基因的作用，對于骨肉瘤、肺癌、胃癌等腫瘤細胞的侵襲和遷移能力具有抑制作用[6-8]。研究報道顯示，miR-195-5p參與IL-17促進子宮內膜癌細胞轉移過程，IL-17可以誘導子宮內膜癌細胞中miR-195-5p表達下調[9]。本次實驗以胃癌細胞AGS為研究對象，探討miR-195-5p在IL-17誘導的胃癌細胞侵襲和遷移中的作用和靶向調控機制，以期為胃癌的治療提供潛在靶點，為研究胃癌分子發生機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 胃癌細胞AGS購自南京科佰生物科技有限公司；IL-17購自碧云天生物技術研究所；mimics control、miR-195-5p mimics由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；Vimentin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；Lipofectamin 2000、吞噬細胞運動蛋白2(engulfment and cell motility 2,ELMO2)抗體購自美國invitrogen公司；E-cadherin抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司；引物由北京優博蘭基因技術有限公司合成；pcDNA3.1-ELMO2、pcDNA3.1購自元生物技術(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染和分組處理 胃癌細胞AGS分成Control、IL-17、IL-17+miR-NC 、IL-17+miR-195-5p共4組，IL-17、IL-17+miR-NC 、IL-17+miR-195-5p組細胞分別用含有100 μg/L的IL-17細胞培養液培養；IL-17+miR-NC、IL-17+miR-195-5p細胞分別為轉染mimics control、miR-195-5p mimics的胃癌細胞AGS；Control細胞為不轉染正常培養的對照細胞。細胞轉染試劑用Lipofectamin 2000，細胞密度為80%時進行細胞轉染，轉染具體操作同轉染試劑說明書。

1.2.2qRT-PCR方法測定細胞中miR-195-5p表達 Control、IL-17、IL-17+miR-NC、IL-17+Anti-195-5p組細胞分別按照1.2.1中方法處理培養24 h以后，用qRT-PCR方法檢測miR-195-5p表達。步驟如下：Trizol試劑提取細胞總RNA，去除DNA。配制反轉錄體系，包含：雜2 μl的RT Enzyme Mix、2 μl的10×Fast RT Buffer、2 μl的FQ-RT Primer Mix，添加Rnase-Free ddH2O至10 μl，放在42℃孵育15 min，然后放在95℃孵育3 min后放在冰上用于qRT-PCR反應。PCR反應體系為：0.4 μl的上下游引物、1 μl的第一鏈cDNA、10 μl的2×miRcute miRNA premix(with SYBR ROX)，添加RNase-Free ddH2O至20 μl。PCR程序為:94℃孵育2 min，94℃孵育20 s，60℃孵育34 s。根據反應得到的CT值采用2-△△CT法分析目的基因miR-195-5p的表達變化。引物序列如下：miR-195-5p上游5′-CGGGATCCACATCTGGGGCCTTGTGA-3′，下游5′-CCCAAGCTTGCTTCGTGCTGTCTGCTT-3′；內參U6上游5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.2.3Transwell小室測定細胞侵襲和遷移能力變化 收集對數生長期的胃癌細胞，按照Control、IL-17、IL-17+miR-NC 、IL-17+miR-195-5p分組方法處理細胞，然后將細胞用不含血清的細胞培養液懸浮并添加到Transwell小室的上室中，每組細胞添加200 μl，在小室的下室中添加含有血清的細胞培養液，放在37℃，5%CO2培養箱中培養24 h。取出小室，用PBS溶液洗滌，以棉簽將沒有穿過膜的細胞擦掉，放在95%的甲醇溶液中浸泡20 min，以PBS洗滌3次，0.2%的結晶紫溶液染色20 min。在顯微鏡下計數穿膜細胞即為細胞遷移數目。細胞侵襲實驗前用Matrigel將小室濕化，其余步驟同遷移實驗。

1.2.4Western blot測定細胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平 收集培養24 h以后的Control、IL-17、IL-17+miR-NC 、IL-17+miR-195-5p組細胞，以預冷后的PBS溶液將細胞洗滌3次，然后用移液器把殘留的液體吸棄。添加RIPA蛋白裂解試劑，放在冰上孵育15 min，以細胞刮子收集細胞，4℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清，用BCA法測定蛋白濃度。把蛋白樣品與1/4體積的5×Loading Buffer混合煮沸5 min后放在冰上備用。分別配制并灌注12%的分離膠以及5%的濃縮膠。在上樣孔中分別添加30 μg變性蛋白樣品，在80 V恒壓條件下電泳40 min以后，觀察染料進入到分離膠，然后將電壓改為120 V繼續電泳至染料跑出凝膠。取PVDF膜于甲醇中孵育1 min，然后放在轉移緩沖液中浸泡10 min。于90 V電壓條件下轉膜50 min。把PVDF膜放在含有5%牛血清白蛋白的封閉液中封閉1 h，然后將PVDF膜放在提前稀釋好的一抗溶液中，在4℃條件下孵育過夜。最后將PVDF膜放在辣根過氧化物酶標記后的二抗溶液中，在37℃孵育1 h。用BeyoEcL Plus顯色試劑盒顯色。用圖像分析軟件Image J分析條帶的灰度值，GAPDH為參照，分析目的蛋白相對表達量。

1.2.5靶基因預測和鑒定 利用TargetScan和DIANA micro T生物信息學軟件預測miR-195-5p的靶基因，發現ELMO2的3′UTR端與miR-195-5p有互補結合位點。分別構建熒光素酶報告載體，載體由湖南普拉特澤生物科技有限公司構建。利用Lipofectamin 2000分別把含有ELMO2的3′UTR端結合位點的WT和突變后ELMO2的3′UTR端結合位點的MUT轉染到胃癌細胞AGS，細胞培養48 h以后，用熒光素酶活性測定試劑盒檢測各細胞熒光素酶活性變化。

1.2.6pcDNA3.1-ELMO2對上調miR-195-5p的細胞侵襲和遷移影響 利用Lipofectamin 2000分別把pcDNA3.1-ELMO2、miR-195-5p mimics和陰性對照載體pcDNA3.1、miR-195-5p mimics共轉染到胃癌細胞AGS中，并用含有100 μg/L的IL-17細胞培養液培養，命名為IL-17+miR-195-5p+vector 、IL-17+miR-195-5p+ELMO2組。細胞培養24 h以后，用Transwell小室測定細胞侵襲和遷移數目(步驟參照1.2.3)，Western blot測定E-cadherin、Vimentin、ELMO2蛋白表達(步驟參照1.2.4)。

2 結果

2.1miR-195-5p mimics上調IL-17條件下胃癌細胞中miR-195-5p表達水平 IL-17處理后的胃癌細胞中miR-195-5p表達水平下降，轉染miR-195-5p mimics后的胃癌細胞經IL-17處理后，細胞中miR-195-5p表達水平升高。見表1。miR-195-5p mimics上調IL-17條件下胃癌細胞中miR-195-5p表達水平。

2.2上調miR-195-5p抑制IL-17誘導的胃癌細胞侵襲和遷移 IL-17處理后的胃癌細胞侵襲數目和遷移數目均升高，細胞中E-cadherin蛋白表達水平下降，Vimentin蛋白表達水平升高；轉染miR-195-5p mimics后的胃癌細胞經過IL-17處理以后，細胞侵襲數目和遷移數目下降，細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高，Vimentin蛋白表達水平下降，見圖1和表2。上調miR-195-5p抑制IL-17誘導的胃癌細胞侵襲和遷移。

GroupsmiR-195-5pControl1.00±0.09IL-170.64±0.061)IL-17+miR-NC0.65±0.08IL-17+miR-195-5p1.26±0.142)F85.65P<0.001

Note:Compared with Control,1)P<0.05;compared with IL-17+miR-NC,2)P<0.05.

2.3miR-195-5p靶向調控ELMO2 ELMO2的3′UTR端與miR-195-5p有互補結合位點，并且WT和miR-195-5p mimics共轉染后的胃癌細胞熒光素酶活性下降，見圖2和表3。miR-195-5p靶向調控ELMO2。

2.4上調miR-195-5p降低IL-17條件下胃癌細胞中ELMO2蛋白表達 IL-17處理后的胃癌細胞中ELMO2蛋白表達水平升高；轉染miR-195-5p mimics后的胃癌細胞經過IL-17處理以后，細胞ELMO2蛋白表達水平下降，見圖3和表4。上調miR-195-5p降低IL-17條件下胃癌細胞中ELMO2蛋白表達水平。

圖1 Western blot方法測定上調miR-195-5p對IL-17誘導的胃癌細胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表達影響Fig.1 Western blot analysis of effect of up-regulating miR-195-5p on expression of E-cadherin and Vimentin in IL-17-induced gastric cancer cellsNote:1.Control；2.IL-17；3.IL-17+miR-NC；4.IL-17+miR-195-5p.

GroupsInvasionnumberMigrationnumberE-cadherinVimentinControl78.32±7.54 96.47±9.55 0.85±0.080.42±0.05IL-17160.24±13.191)179.24±14.521) 0.55±0.061)0.75±0.071)IL-17+miR-NC159.45±12.08 177.86±15.48 0.56±0.050.74±0.06IL-17+miR-195-5p85.75±6.362)108.77±10.292) 0.78±0.092) 0.50±0.052)F174.49108.3140.8375.09P<0.001<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with Control,1)P<0.05;compared with IL-17+miR-NC,2)P<0.05.

圖2 ELMO2與miR-195-5p互補結合位點Fig.2 Complementary binding sites of ELMO2 and miR-195-5p

2.5pcDNA3.1-ELMO2促進上調miR-195-5p的胃癌細胞侵襲和遷移 與共轉染miR-195-5p mimics和對照載體pcDNA3.1后的胃癌細胞比較，共轉染miR-195-5p mimics和pcDNA3.1-ELMO2后的細胞經過IL-17誘導處理以后，細胞侵襲數目和遷移數目增多，細胞中E-cadherin蛋白水平降低，Vimentin、ELMO2蛋白水平升高，見圖4和表5。pcDNA3.1-ELMO2促進轉染miR-195-5p mimics后的胃癌細胞侵襲和遷移。

GroupsMUTWTmiR-NC1.00±0.081.00±0.11miR-195-5p0.97±0.130.41±0.061)t0.5914.13P0.56<0.001

Note:Compared with miR-NC，1)P<0.05.

圖3 Western blot測定上調miR-195-5p對IL-17誘導的胃癌細胞中ELMO2蛋白表達影響Fig.3 Western blot analysis of effect of miR-195-5p on expression of ELMO2 protein in IL-17-induced gastric cancer cellsNote:1.Control；2.IL-17；3.IL-17+miR-NC；4.IL-17+miR-195-5p.

2.6pcDNA3.1-ELMO2促進上調miR-195-5p的胃癌細胞侵襲和遷移 與共轉染miR-195-5p mimics和對照載體pcDNA3.1后的胃癌細胞比較，共轉染miR-195-5p mimics和pcDNA3.1-ELMO2后的細胞經過IL-17誘導處理以后，細胞侵襲數目和遷移數目增多，細胞中E-cadherin蛋白水平降低，Vimentin蛋白水平升高，見圖5和表6。pcDNA3.1-ELMO2促進轉染miR-195-5p mimics后的胃癌細胞侵襲和遷移。

GroupsELMO2Control0.29±0.04IL-170.79±0.081)IL-17+miR-NC0.81±0.07IL-17+miR-195-5p0.40±0.052)F166.20P<0.001

Note:Compared with Control,1)P<0.05;compared with IL-17+miR-NC,2)P<0.05.

圖4 Western blot測定pcDNA3.1-ELMO2對上調miR-195-5p的胃癌細胞中E-cadherin、Vimentin、ELMO2表達影響Fig.4 Effect of pcDNA3.1-ELMO2 on expression of E-cadherin,Vimentin and ELMO2 in gastric cancer cells up-regulating miR-195-5p by Western blotNote:1.IL-17+miR-195-5p+vector；2.IL-17+miR-195-5p+ELMO2.

GroupsInvasion numberMigration number E-cadherinVimentinELMO2IL-17+miR-195-5p+vector86.86±7.54110.59±11.230.74±0.080.54±0.070.41±0.06IL-17+miR-195-5p+ELMO2122.79±10.271)166.48±15.201)0.49±0.051)0.89±0.091)0.83±0.071)t8.468.877.959.2113.67P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with IL-17+miR-195-5p+vector,1)P<0.05.

3 討論

IL-17是主要由Th17細胞分泌的促炎因子，其在腫瘤中可以促進血管生成和腫瘤轉移[10]。IL-17在腫瘤患者中高表達，腫瘤患者局部產生的IL-17可以調控腫瘤微環境血管形成，阻斷IL-17是腫瘤治療的一種新策略[11]。研究報道證實，IL-17可以明顯促進胃癌細胞的遷移和侵襲[12]。實驗結果表明，IL-17處理后的胃癌細胞侵襲和遷移能力升高，細胞上皮標志蛋白E-cadherin表達減少，間質標志蛋白Vimentin表達水平升高，說明IL-17可以誘導胃癌細胞轉移，這與上述研究結果相一致。

miRNA進化極為保守，屬于多功能調控因子，其可以通過影響下游基因或信號的轉導參與細胞生長、分化以及胚胎發育、能量代謝等過程[13]。很多研究證實，疾病的發生與miRNA異常表達有關，靶向調控miRNA的表達可能是疾病治療的途徑[14]。miR-195-5p僅在哺乳動物中表達，其基因定位在17pl3.1染色體上，miR-195-5p在不同的組織以及疾病進展中的作用靶點不同，生物學功能也不相同[15]。研究表明，miR-195-5p在前列腺癌、胃癌等腫瘤中表達下調，miR-195-5p表達下降能夠促進腫瘤轉移[8,16]。在子宮內膜癌中發現，miR-195-5p參與調控IL-17誘導的子宮內膜癌細胞轉移過程[9]。我們的實驗顯示，IL-17處理后的胃癌細胞中miR-195-5p表達水平下調，上調miR-195-5p可以抑制IL-17誘導的腫瘤細胞侵襲和遷移。我們的結果表明，IL-17可以降低胃癌細胞中miR-195-5p表達水平，并且上調miR-195-5p可以降低IL-17誘導的胃癌細胞侵襲和遷移能力，這說明miR-195-5p在IL-17誘導的胃癌細胞侵襲和遷移中扮演抑制作用，這與上述研究結果相符合，說明miR-195-5p參與IL-17誘導的腫瘤細胞轉移。

miRNA靶基因有多個，這也是其功能多樣的重要原因[17]。不同組織不同生理或病理過程中miRNA的靶基因可能不同，并且同一個miRNA可能同時調控多個靶基因[18-20]。我們的實驗顯示，miR-195-5p靶向負調控胃癌細胞中ELMO2的表達。ELMO2是ELMO蛋白家族成員，其是由727個氨基酸組成的支架蛋白，可以同多個蛋白質相互結合從而發揮不同的生物學作用[21，22]。ELMO2參與細胞吞噬、侵襲和遷移，與腫瘤發生有關[23]。研究顯示，ELMO2在胃癌中表達上調，下調其表達可以抑制胃癌細胞的侵襲和遷移[24]。本實驗結果表明，ELMO2可以逆轉miR-195-5p對IL-17誘導的胃癌細胞侵襲遷移的抑制作用，提示miR-195-5p通過靶向抑制ELMO2表達發揮抗IL-17誘導的胃癌細胞侵襲和遷移作用。

綜上，miR-195-5p參與IL-17誘導的胃癌轉移過程，其可以抑制IL-17誘導的胃癌細胞侵襲和遷移，作用機制與靶向調控ELMO2有關。本次實驗結果為研究miR-195-5p在胃癌進展和腫瘤微環境中的調控機制提供了參考，為基因治療胃癌提供了可能。