酶法輔助聚二乙醇-200提取杜仲葉中綠原酸的工藝

劉霞*，楊瑩，劉劍輝

贛南醫學院（贛州 341000）

杜仲葉為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides）的干燥葉[1]，其藥理作用十分顯著，對于防治骨質疏松、改善疲勞、防止衰老、增強機體免疫功能和降血壓等具有較好的效果，和杜仲皮的有效成分和藥理作用相似[2-3]。杜仲葉綠原酸是杜仲中重要的藥物活性物質之一，其抗氧化作用和抑菌活性較強，對多種菌如大腸桿菌、乳房鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌、白色葡萄球菌等均具有抑制作用[4-5]。目前關于杜仲葉中綠原酸的提取方法常用的有超聲法[6]、微波輔助提取法[7]及生物酶法[8]等。但這些方法存在成本高、溶劑耗量大且提取率低等問題。研究一種工藝條件溫和、操作簡便、成本低且提取率高的綠原酸提取工藝對杜仲產業的發展意義重大。

聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）-200成本較低、不易揮發、性質比較穩定、安全無毒，是一種環保溶劑[9]。纖維素酶法能有效水解細胞壁上的纖維素，加速有效成分溶出，從而提高提取效果[10-11]。目前采用酶法輔助PEG-200提取杜仲葉綠原酸的研究仍鮮見報道。試驗以杜仲葉為原材料，采用酶法輔助PEG-200提取綠原酸，并用Box-Behnken中心組合試驗方法優化其提取工藝，從而為杜仲葉資源的綜合開發利用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

杜仲葉藥材，市售，經贛南醫學院程齊來教授鑒定為杜仲科植物杜仲的葉。

綠原酸對照品，天津一方科技有限公司；纖維素酶（5×104U·g-1），江蘇銳陽生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

SPECORD 50 PLUS型紫外分光光譜儀，德國耶拿分析儀器股份公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；SQP型電子天平，塞多利斯科學儀器（北京）有限公司；FS500Y-3型搖擺式粉碎機，廣州雷邁機械設備有限公司；Hei-VAP Value Digital G3旋轉蒸發儀，德祥Tengent；SHA-C數顯水浴恒溫振蕩器，金壇市城東新瑞儀器廠；SHZ-III循環水式真空泵，上海亞榮生化儀器廠；DHG9246A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；PB-10酸度計，賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

精密稱取10.16 mg的綠原酸標準品，用30% PEG-200定容至100 mL，配制101.6 μg·mL-1的母液，再精密量取0，0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 mL母液，分別置于10 mL容量瓶中，加30% PEG-200至刻度，搖勻，靜置，配制成0，3.12，6.23，9.35，12.47和15.59 μg·mL-1的標準溶液。測定各標準溶液在329 nm的吸光度。以吸光度A為縱坐標，綠原酸濃度C為橫坐標，繪制標準曲線：A=0.051C+0.003 9，R2=0.999 8。

1.2.2 杜仲葉綠原酸的提取

將50℃恒溫烘干后的杜仲葉粉碎，過60目篩。準確稱取5.0 g杜仲葉粉末，置于250 mL具塞錐形瓶中，按不同的料液比加入30%的PEG-200，鹽酸調pH，充分攪拌，再添加適量的纖維素酶，在不同溫度下恒溫酶解一定時間后，在80℃條件下回流提取15 min，趁熱過濾，濾液適當減壓濃縮，并用30% PEG-200定容于50 mL的容量瓶中，備用。

1.2.3 綠原酸提取率測定

精密量取上述提取液，并按一定比例稀釋后，按照標準曲線下的測定方法測吸光度，計算綠原酸提取率。

1.2.4 單因素試驗

采用單因素試驗研究酶用量、料液比、酶解溫度、pH及酶解時間對杜仲葉綠原酸提取效果的影響。

1.2.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，酶解溫度對綠原酸提取率影響不大，固定酶解溫度50℃。以酶用量（A）、料液比（B）、pH（C）及酶解時間（D）為自變量，以-1，0和+1代表自變量的低、中、高水平，以綠原酸提取率為響應值進行響應面分析。試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖1可以看出，當酶用量逐漸增加至1.2%時，綠原酸提取率增幅較大；當酶用量超過1.2%時，綠原酸的提取率反而呈下降趨勢。這是因為酶用量增加到一定程度時，酶與底物濃度處于相對飽和狀態，繼續增加酶用量，會導致部分酶不僅不能與底物結合，反而會抑制綠原酸成分的浸出，因而綠原酸提取率有所下降[12]。因此選擇酶用量的比例為1.2%。

2.1.2 料液比對杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖2可知，隨著料液比逐漸增加，綠原酸提取率先增加后降低，當料液比為1∶25（g/mL）時綠原酸提取率達到最大值，之后提取率開始下降，因此選擇1∶25（g/mL）為最佳料液比。

圖1 酶用量對綠原酸提取率的影響

圖2 料液比對綠原酸提取率的影響

2.1.3 酶解溫度對杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖3可以看出，隨著酶解溫度的增加，綠原酸提取率先逐步增加。當酶解溫度為50℃時，綠原酸提取率達到最大值。后續隨著酶解溫度的增加，綠原酸提取率開始下降。這是因為纖維酶的活力都有最適溫度，偏離最適溫度會引起酶的失活[13]。因此，試驗的酶解溫度定為50℃。

圖3 酶解溫度對綠原酸提取率的影響

2.1.4 pH對杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖4可知，隨著pH的增加，綠原酸提取率先呈上升趨勢。當pH達到4.5時，提取率達到最大值，而后提取率逐步下降。這可能是酸性纖維素酶在pH 4.5時活力作用最強，穩定性最好。故試驗選擇最佳pH 4.5。

2.1.5 酶解時間對杜仲葉綠原酸提取率的影響

由圖5可知，隨著酶解時間的增加，綠原酸提取率先呈逐步上升趨勢。當酶解時間為2 h時，提取率達到最大值，之后繼續延長酶解時間，提取率明顯下降。這是由于綠原酸本身的不穩定性，長時間加熱會導致部分綠原酸發生異變和分解，因而提取率下降。故試驗將最佳酶解時間定為2 h。

圖4 pH對綠原酸提取率的影響

圖5 酶解時間對綠原酸提取率的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

響應面分析方案與結果見表2。應用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得出方差分析表，見表3。

通過多元回歸擬合分析得到杜仲葉中綠原酸提取率（Y）與酶用量（A）、料液比（B）、pH（C）和酶解時間（D）之間的二次多項回歸方程：Y=-17.705 4- 1.362 5A-0.146 8B+10.488 3C-0.196 7D+0.105 0AB+ 0.275 0AC-0.450 0AD+0.037 0BC+0.050 0BD+0.190 0CD- 0.802 1A2-4.483 3E-003B2-1.333 3C2-0.398 3D2。

由表3可以看出回歸方程的p＜0.01，表明此回歸模型達到極顯著水平。模型的相關系數R2=95.65%，調整系數R2Adj=91.31%，均大于90%，表明方程對試驗擬合良好，試驗結果誤差小，可用于擬合杜仲葉中綠原酸的最佳提取工藝。一次項A、B、C、D，交互項AB、AD、BC、BD，二次項A2、B2、C2、D2對試驗結果影響顯著（p＜0.05），表明酶用量、料液比、pH和酶解時間對杜仲葉中綠原酸提取率影響顯著，且影響順序（主→次）為酶用量＞酶解時間＞料液比＞pH。交互項AD、BC的p＜0.05，表明酶用量與酶解時間、料液比與pH的交互作用對杜仲葉中綠原酸提取率影響顯著，交互項AB、BD的p＜0.01，表明酶用量與料液比、料液比與酶解時間的交互作用對杜仲葉綠原酸的提取率影響達到了極顯著的水平。

表2 Box-Behnken中心組合試驗結果

表3 響應面方差分析結果

2.2.2 響應面交互作用分析及最佳提取工藝研究

各試驗因素間的交互作用對杜仲葉綠原酸提取率影響的3D分析結果見圖6。由圖6可知，酶用量對杜仲葉綠原酸提取率影響最顯著，表現為響應曲面坡度較陡峭；酶解時間和料液比影響次之，表現為曲面稍平滑；最后為pH，表現為曲面更平緩。各試驗因素間的交互作用對杜仲葉綠原酸提取率影響與表3中交互相的方差分析結果一致。

根據Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行優化分析，得到最佳工藝參數：酶用量0.8%，料液比1∶20（g/mL），pH 4.4，酶解時間1.6 h。在此工藝條件下進行3次平行試驗，結果得到的實際提取率為3.15%，與預測值3.23%相差較小，相對誤差為2.48%，說明此模型合理可靠，能夠較好地擬合杜仲葉綠原酸的提取過程。

圖6 各兩因素交互作用對杜仲葉綠原酸提取率影響的響應面圖

2.3 不同提取方法的對比

由表4可知，相比單技術回流法，酶法聯合回流法提取杜仲葉中綠原酸雖耗時更長，但得率提高近1倍，說明在回流法的基礎上增加酶預處理步驟可有效提高杜仲葉中綠原酸的得率。

表4 不同提取方法提取綠原酸的比較（±s，n=3）

表4 不同提取方法提取綠原酸的比較（±s，n=3）

序號 提取方法 提取時間 杜仲葉綠原酸提取率/%1 酶法聯合回流法 1．85 h 3．15±0．32 2 回流法 15 min 1．87±0．19

3 討論與結論

通過響應面分析方法的優化，采用酶法輔助PEG-200提取杜仲葉中綠原酸的最佳工藝條件為：酶用量0.8%、料液比1∶20（g/mL）、pH 4.4、酶解時間1.6 h。在此試驗條件下實際提取率為3.15%，與預測值基本一致，說明此模型合理可靠，可以很好地分析和預測杜仲葉中綠原酸的提取工藝。此法相比單技術回流法，雖耗時更長，但得率提高近1倍，說明在回流法的基礎上增加酶預處理步驟可有效提高杜仲葉中綠原酸的得率。此研究結果可為綠原酸提取純化工藝的進一步研究提供一定的參考依據。