超聲波輔助提取紫蘇色素的工藝優化

徐少峰，秦磊*，吳鵬*

黃岡師范學院生物與農業資源學院，經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，大別山特色資源開發湖北省協同創新中心（黃岡 438000）

合成色素也稱煤焦色素或苯胺色素。所用原料是煤焦油，對人體健康基本上是百害而無一利。有些食品已被禁止使用合成色素：諸如所有的肉及相關肉制品、魚和海鮮、醋、醬油、腐乳等調味品。而天然色素受到了人們的關注與青睞，天然色素營養豐富，適合人體食用。目前，隨著人們對于食品安全的關注，天然色素有望逐漸代替化學色素[1]。天然食用色素是從動物、植物、微生物或微生物代謝產物中提取出來的[2]，這些從食物中得到的天然色素更容易受到消費者的歡迎和喜歡，食用起來也更安全。

絕大部分植物色素沒有副作用，安全性能高[3]。與其他的天然食品相比，天然色素最主要的特點是其具有抗氧化活性[4]。植物色素的顏色自然，可以增添顏色，而植物中色素含量較低，提取有限，并且對其分離純化的技術也不成熟。大部分植物色素穩定性都較差，有些植物色素在使用過程中還須添加氧化劑、穩定劑來延長商品的貨架期。同時天然色素的優點也將會開拓其在醫藥、日化等方面更開闊的應用領域。

紫蘇（學名：Perilla frutescens（L.）Britt.），別名：桂荏、赤蘇等；唇形科草本植物，可藥食兩用[5-6]。紫蘇色素屬于花青素色素。它的主要成分是紫蘇素（Shisoinn）和紫蘇寧（Shisolaimn）[7]。紫蘇的葉、莖、果均可入藥[8]，作為中藥具有解毒、散寒、行氣和胃的功效[9]。紫蘇起源于中國，主要分布在印度、緬甸、日本、韓國、韓國、印度尼西亞和俄羅斯等國家[10]。紫蘇在美國、日本、加拿大、俄羅斯等國家作為一種美食，主要被用于壽司、配菜和湯中[11]。紫蘇有特異芳香，適應性很強，容易栽培。

蔡寧晨[12]在對紫蘇葉花色苷的提取分析及其功能的研究中，通過抑菌試驗發現：紫蘇葉花色苷在預防和治療由細菌引起的疾病方面有一定潛能。由吳周和等[13]對紫蘇色素的提取及其熱穩定性研究分析可知，在吸收光譜中，530 nm處有最大吸收峰，主要成分是紫蘇花色素苷，使提取液呈紅色。另外在420 nm處也出現了一較大的吸收峰，據推測，其成分可能是葉綠素及黃酮類化合物，可通過旋轉蒸發儀將葉綠素等盡可能蒸出，最后得到紫蘇色素的紫紅色濃縮液，再測其吸光度發現420 nm處沒有吸收峰。

隨著功能性食品添加劑市場的擴張，天然食用色素將會以保健品的形式添加出現，天然植物色素最大的缺點就是穩定性很差，提取后顏色易變化，而我國植物色素的有些生產廠家技術落后，設備簡陋，產品質量穩定性更差[14]。由苑玉莉等[15]對紫蘇中花色素的提取及儲藏穩定性的研究得出，紫蘇花色素苷的儲藏條件是冷凍、避光、隔氧。

而且徐建越[17]對紫蘇色素的提取及理化性質的研究發現，升高提取溫度、延長提取時間可提高提取率。紫蘇色素色調變化大，穩定性差。紫蘇色素對低熱（＜60℃）較穩定，對高熱（＞80℃）穩定性較差[16]。紫蘇色素在各種介質中熱穩定性大小的排列順序為：檸檬酸＞淀粉＞蔗糖=CaCl2＞NaCI＞苯鉀酸鈉＞VC。故而可以應用于酸性飲料、水果制品、乳酸飲料等中[17]。長時間的光照也會對紫蘇葉花色苷造成影響，隨著光照時間的增長，紫蘇葉花色苷的色彩密度和聚合色素都有一定程度的降低。由陳勇等[18]對不同pH條件下紫蘇色素降解動力學的研究發現：對于不同的pH而言，紫蘇色素熱降解反應隨著pH的增大而加快。故酸性環境有利于減少紫蘇色素的降解。

劉玉萍[19]通過離心過濾的方法提取紫蘇色素得出了紫蘇色素在可見光范圍內的最大吸收峰為360 nm，由L16(45)正交試驗確定了影響色素提取效果的最主要因素是料液比。并得出紫蘇色素提取的最佳工藝條件：超聲波頻率為中頻（47.6 kHz），提取溶劑為55%乙醇，提取時間15 min，提取溫度60℃，料液比1∶15（g/mL）。吳周和等[13]以酸性甲醇為提取溶劑，得出了料液比對提取率影響最為顯著。紫蘇葉色素的最佳提取工藝條件為：提取劑為1% HCl-甲醇溶液，提取溫度為50℃，提取時間為3 h，料液比為1∶15（g/mL）[20]。由前人的試驗結果可以看到，大家所得的結果不盡相同，當然這也可能是儀器誤差、溫度誤差、操作誤差等的存在以及所選擇的試劑不同所造成的。

超聲波輔助提取是利用超聲場的方法從天然產物中提取活性成分。其原理是在存在于物質中的微氣核空化核在超聲場的作用下產生振動、生長和崩潰的過程，即超聲空化效應，從而產生局部的高溫高壓，增強物質在溶劑中的溶解能力[21]。

試驗通過超聲波輔助提供一種優化紫蘇色素提取效果的工藝方案，采用單因素試驗和正交試驗分析得到最佳提取工藝條件，進而為實現紫蘇色素提取的工業擴大化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉經烘干粉碎后備用；無水乙醇（分析純）；蒸餾水（實驗室自制）。

1.2 儀器與設備

DFT-200C 200克手提式萬能高速粉碎機，上海比朗儀器有限公司；YP1201N電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；KQ-500DB型數控超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；SP-723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；

1.3 方法

1.3.1 確定最大吸收波長

稱取已備好的紫蘇粉末0.200 0 g為一份的用量，以料液比1∶30（g/mL）加入提取溶劑無水乙醇6 mL，在超聲功率240 W下，超聲9 min后將所得液體在真空泵的作用下抽濾，再加入蒸餾水在100 mL的容量瓶中定容，通過紫外可見分光光度計在400～600 nm進行全波段掃描，測得最大吸收波長為415 nm。

1.3.2 超聲波輔助提取紫蘇色素的單因素試驗

主要考慮以下三個因素對提取效果的影響：超聲的時間，超聲的功率，料液比。

超聲時間對提取紫蘇色素的影響：稱取紫蘇粉末0.200 0 g五份，以料液比1∶30（g/mL）加入提取溶劑無水乙醇6 mL，在超聲功率240 W下，由不同的超聲時間（6，12，18，24和30 min），將所得液體在真空泵的作用下抽濾，再加入蒸餾水在100 mL的容量瓶中定容，使用紫外可見分光光度計檢測它們在415 nm處的吸光度。

超聲功率對提取紫蘇色素的影響：稱取紫蘇粉末0.200 0 g五份，以料液比1∶30（g/mL）都加入提取溶劑無水乙醇6 mL，由不同的超聲功率（180，240，300，360和420 W），超聲9 min后將所得液體在真空泵的作用下抽濾，再加入蒸餾水在100 mL的容量瓶中定容，使用紫外可見分光光度計檢測它們在415 nm處的吸光度。

料液比對提取紫蘇色素的影響：稱取紫蘇粉末0.200 0 g五份，由不同的料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（g/mL））分別加入對應量的提取溶劑無水乙醇，在超聲功率240 W下，超聲9 min后將所得液體在真空泵的作用下抽濾，再加入蒸餾水在100 mL的容量瓶中定容，用紫外可見分光光度計檢測它們在415 nm處的吸光度。

1.3.3 正交試驗確定最佳提取工藝

超聲時間、超聲功率、料液比對紫蘇色素的提取效果都有或多或少的影響。通過正交試驗分析這3個因素在3水平上對紫蘇色素提取效果的影響大小及最優值，設計如表1所示。

表1 因素水平表

2 結果與分析

2.1 單因素對提取效果的影響

2.1.1 超聲時間對紫蘇色素提取效果的影響

試驗結果見圖1。紫蘇色素提取的吸光度隨超聲時間的增大而增大。但到了24 min之后，紫蘇色素提取的吸光度提高變緩，應該是比較接近最佳時間了，在五組試驗中30 min為最佳提取時間。關鍵是紫蘇色素確實極不穩定，所以沒有接著繼續進行后續試驗。

2.1.2 超聲功率對紫蘇色素提取效果的影響

試驗結果見圖2，紫蘇色素提取液的吸光度在超聲功率為360 W之前呈增長態勢，這是因為隨著超聲功率的提高，紫蘇色素在提取溶劑中的傳質速率加快，溶解速度也加快，體現了超聲波在破壞細胞壁結構來促使細胞內成分溶出的高效性，所以紫蘇色素提取的效果提高。超聲功率超過360 W之后吸光度就下降了，是因為超聲功率太大了，紫蘇色素的結構可能被破壞，使其含量下降。說明在超聲功率360 W時紫蘇色素的提取吸光度最大。故選擇360 W為最佳提取超聲功率。

圖1 超聲時間對提取效果的影響

圖2 超聲功率對提取效果的影響

2.1.3 料液比對紫蘇色素提取效果的影響

試驗結果見圖3，開始吸光度隨料液比的增大而增大，這是因為料液比增大，提取溶劑用量增大，紫蘇色素溶解量就增大。紫蘇色素的提取吸光度在料液比為1∶50（g/mL）時有最大值，之后又呈下降趨勢，是因為溶劑過大了，紫蘇色素提取溶劑中的傳質速率減小從而使其溶解量減小，導致提取效果的下降，同時，溶劑用量太大也會造成浪費。故選擇1∶50（g/mL）為最佳提取料液比。

圖3 料液比對提取效果的影響

2.2 正交試驗結果及分析

A、B、C分別表示超聲時間、超聲功率、料液比這三個因素，D表示空白，經過正交試驗得出的結果如表2所示，方差分析如表3所示。

由表3可得，影響紫蘇色素提取效果的因素的主次順序是A＞B=C，即超聲時間＞料液比=超聲功率，超聲時間對紫蘇色素提取效果影響最大，料液比和超聲功率的影響一樣。其最優組合是A3B3C3，故超聲波輔助提取紫蘇色素的最佳工藝條件是超聲時間為30 min，料液比為1∶60（g/mL），超聲功率為420 W。

表2 正交試驗結果表

表3 方差分析表

3 討論與結論

試驗中發現紫蘇色素不穩定，放置后提取溶液會由偏暗橙黃色變為黃綠色。將提取液抽濾，用旋轉蒸發儀濃縮至略帶黏稠狀的深紅色液體，即得到紫蘇色素樣品。在真空濃縮的后期，出現深黃綠色的凝塊，可能是葉綠素析出[13]。試驗得到的紫蘇色素為黃綠色，比較透亮，另一方面可能是其中還有未分離出來的葉綠素的緣故。由蔡寧晨[12]的研究發現，當處于酸性條件尤其是pH為2～4的環境中，紫蘇葉花色苷是比較穩定的。pH≥7時，紫蘇葉花色苷會被分解為其他物質，呈淺黃色。

試驗結果分析中，方差分析表里沒能得到顯著性，可能是因為研究的影響因素有限，只是研究了三個因素的影響。食品的色澤是食品的一項重要感官指標，要想真正用上天然色素，并且廣泛多領域使用，就急需研制護色劑或制定出良好的護色方案。

正交優化所得的超聲波輔助提取紫蘇色素的最佳提取工藝條件為：超聲時間30 min，料液比1∶60（g/mL），超聲功率420 W。紫蘇資源豐富又分布廣泛，是提取天然色素的較佳原料，為紫蘇色素提取的工業化提供了理論基礎。