雙酶法制備豌豆肽及其抗氧化活性

宋明洋，劉曉蘭*

齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（齊齊哈爾 161006）

豌豆屬于豆科植物，在中國(guó)各地均有栽種，分布在多個(gè)地區(qū)，如四川、江蘇、湖北、河南、青海等[1]。豌豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、維生素C、胡蘿卜素和微量元素。和其他種類蛋白相比，豌豆蛋白是一種比較理想的植物蛋白，含有亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等必需氨基酸[2]。國(guó)內(nèi)有關(guān)企業(yè)對(duì)豌豆的加工利用主要是采用其淀粉來生產(chǎn)粉條、粉絲等食品，沒有充分利用豌豆蛋白，造成資源浪費(fèi)。

豌豆蛋白中抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸、單寧的存在使其不能很好的被人體吸收利用。植源性生物活性肽由于其特殊的生理功能、良好的加工功能性、安全性高和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)具有較好的市場(chǎng)前景[3]。單酶水解制備的豌豆蛋白水解物具有增加免疫力、降血壓、降膽固醇等生物活性[4-7]。但單酶水解的不足之處是由此制備的豌豆肽具有較低水解度和活性，而不同蛋白酶的作用位點(diǎn)有很大差異，采用雙酶協(xié)同酶解是提高水解物短肽得率和水解度的可行方法。

試驗(yàn)以豌豆蛋白粉為原料，采用雙酶水解的方法制備豌豆蛋白水解物，以Fe2+螯合能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其水解產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行初步研究，為豌豆蛋白的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

豌豆蛋白粉（山東健源生物科技有限公司）；蛋白酶（南寧東恒華道生物科技有限公司）；菲啰嗪（生工生物工程（上海）股份有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要設(shè)備與儀器

DF-1型集熱式磁力加熱攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；PB-10型pH計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TCL-16G型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PC/PLC-LD-53型冷凍干燥機(jī)（美國(guó)MILLROCK公司）；TU-1810型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶解方法

單酶水解方法：豌豆蛋白粉溶液（底物濃度10%）→調(diào)節(jié)反應(yīng)pH→調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度→加酶→恒溫恒pH水解→高溫煮沸（10 min）→冷卻→離心（4 000 r/min，15 min）→上清液→冷凍干燥→豌豆肽凍干粉。

雙酶水解方法：第1種酶水解后加入第2種酶進(jìn)行水解，其他步驟同單酶水解方法。

1.3.2 水解度的測(cè)定

水解度（DH）的測(cè)定采用pH-Stat法[8]。

1.3.3 豌豆肽的抗氧化活性測(cè)定

Fe2+螯合能力的測(cè)定根據(jù)Kong等[9]的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白酶對(duì)豌豆蛋白水解度的影響

根據(jù)蛋白酶生產(chǎn)廠家提供的酶最適反應(yīng)溫度及反應(yīng)pH（表1），底物濃度10%且加酶量3.0%時(shí)，以DH為指標(biāo)，比較5種蛋白酶對(duì)豌豆蛋白的水解效果，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選出水解度較高的2種蛋白酶進(jìn)行雙酶分段水解試驗(yàn)。

研究蛋白酶種類對(duì)豌豆蛋白水解度的影響，結(jié)果見圖1。

在試驗(yàn)所用5種酶里，復(fù)合蛋白酶酶解豌豆蛋白的水解度最高，為26.1%，其次是堿性蛋白酶，水解度為22.9%，風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的水解度都在17%左右，木瓜蛋白酶的水解度最低，為5.7%。這主要和兩方面有關(guān)：一是蛋白酶的作用位點(diǎn)，二是豌豆蛋白的自身組成。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶的水解度最低是因?yàn)檫@2種蛋白酶的水解位點(diǎn)較專一；風(fēng)味蛋白酶是氨基端外切酶，只能水解氨基端的氨基酸；復(fù)合蛋白酶由內(nèi)切酶和端肽酶等組成，所以與其他種類蛋白酶相比有更多的作用位點(diǎn)；堿性蛋白酶是一種絲氨酸型的內(nèi)切蛋白酶，作用位點(diǎn)廣泛，專一性不強(qiáng)。此外，豌豆蛋白的等電點(diǎn)在pH 4.5附近，溶液從pH 4.6繼續(xù)增加時(shí)，豌豆蛋白的負(fù)電荷增加，在靜電排斥作用下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，相互纏繞的分子伸展開，彼此之間的間隙增加。因此復(fù)合蛋白酶（簡(jiǎn)稱P酶）和堿性蛋白酶（簡(jiǎn)稱A酶）酶解豌豆蛋白的效果較好，選擇這2種蛋白酶作為后續(xù)試驗(yàn)用酶。

表1 不同蛋白酶的反應(yīng)條件

圖1 不同種類蛋白酶對(duì)豌豆蛋白水解度的影響

2.2 單酶水解單因素試驗(yàn)

2.2.1 加酶量對(duì)水解度的影響

堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)豌豆蛋白水解度的影響結(jié)果見圖2。

2種酶酶解豌豆蛋白得到的水解度基本和酶底比呈正相關(guān)，A酶加酶量超過3.0%時(shí)有小幅下降，P酶加酶量超過3.0%時(shí)增長(zhǎng)緩慢，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)初始階段，酶濃度較低而底物濃度較高，這對(duì)水解過程有促進(jìn)作用，隨著加酶量增大，水解度增加。但水解反應(yīng)到一定程度時(shí)，底物濃度下降，此時(shí)酶添加量達(dá)到飽和，阻礙反應(yīng)進(jìn)行，水解度增加緩慢。酶是蛋白質(zhì)中的一種，加酶量超過其最適加酶量時(shí)，酶分子中的一部分用來水解蛋白酶，阻礙酶對(duì)底物的水解，導(dǎo)致水解度下降[10]。故選擇2種蛋白酶酶底比3.0%。

圖2 酶底比對(duì)豌豆蛋白水解度的影響

2.2.2 pH對(duì)水解度的影響

pH對(duì)堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解豌豆蛋白水解度的影響結(jié)果見圖3。

隨著pH增加，A酶和P酶的水解度呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，pH 9.5時(shí)A酶水解豌豆蛋白得到的水解度最大，pH 9.0時(shí)P酶水解豌豆蛋白得到的水解度最大。這是因?yàn)閜H能影響酶活性部位上相關(guān)基團(tuán)的一些活動(dòng)比如解離等，進(jìn)而影響與底物蛋白反應(yīng)，但是酶只有在pH最適條件下，才能達(dá)到最大反應(yīng)速率。pH過高或過低即不在酶的最適反應(yīng)范圍時(shí)會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)空間，從而改變酶的分子構(gòu)象，降低酶活性甚至使其失活[11]。故選擇A酶的最適pH 9.5，P酶的最適pH 9.0。

圖3 pH對(duì)豌豆蛋白水解度的影響

2.2.3 溫度對(duì)水解度的影響

反應(yīng)溫度對(duì)堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解豌豆蛋白水解度的影響結(jié)果見圖4。

隨著溫度增加，2種蛋白酶的水解度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，50℃時(shí)A酶水解豌豆蛋白的水解度最大，P酶水解豌豆蛋白在55℃時(shí)得到的水解度最大。這是因?yàn)椴煌傅淖钸m催化溫度不同，酶解溫度不在其最適反應(yīng)范圍時(shí)，會(huì)降低酶活性，而酶解溫度過高時(shí)，會(huì)造成酶活性中心的次級(jí)鍵斷裂，使酶失活甚至變性[12]。在低于最適溫度時(shí)，升高溫度能加快分子運(yùn)動(dòng)速率，從而增加底物分子與酶分子兩者之間的結(jié)合幾率，提高酶解效果。溫度繼續(xù)升高且超過酶的最適溫度時(shí)，會(huì)破壞酶分子的空間構(gòu)象導(dǎo)致酶變性失活，從而降低反應(yīng)速率。故選擇A酶和P酶的最適反應(yīng)溫度50℃和55℃。

圖4 溫度對(duì)豌豆蛋白水解度的影響

2.2.4 時(shí)間對(duì)水解度的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解豌豆蛋白水解度的影響結(jié)果見圖5。

隨著時(shí)間增加，2種酶的水解度均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，A酶酶解超過4 h、P酶酶解超過3 h后趨向平緩，這與酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有關(guān)，在酶解反應(yīng)初期，底物與酶特異性結(jié)合，大分子蛋白質(zhì)被分解為多種混合物包括小分子肽和氨基酸等，酶解底物減少濃度降低會(huì)減少酶切作用位點(diǎn)，蛋白酶活性下降，另一方面，酶解產(chǎn)物的大量積累對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，因此酶解反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，水解度增長(zhǎng)平緩。除此之外綜合考慮到節(jié)約能源和時(shí)間，故選擇A酶的最適反應(yīng)時(shí)間4 h，P酶的最適反應(yīng)時(shí)間3 h。

圖5 時(shí)間對(duì)豌豆蛋白水解度的影響

2.3 單酶水解正交試驗(yàn)優(yōu)化

在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以DH為指標(biāo)，固定溫度，采用正交表對(duì)加酶量、pH、時(shí)間進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化從而確定最佳工藝條件。

2.3.1 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)優(yōu)化

堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交試驗(yàn)因素水平表如表2所示。

表2 堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交試驗(yàn)因素水平表

堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

由極差分析可知，在水解過程中3種因素對(duì)水解度的影響依次為：B（酶解pH）＞A（加酶量）＞C（酶解時(shí)間）。依據(jù)極差分析確定水解工藝最優(yōu)組合為A3B2C2，而9組正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合是A2B2C3，對(duì)2組試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證和比較，A3B2C2水解度為33.8%，比A2B2C3的32.3%大，因此選擇A3B2C2為最優(yōu)酶解工藝組合，即加酶量3.0%、pH 9.5、酶解時(shí)間4.0 h。

2.3.2 復(fù)合蛋白酶正交試驗(yàn)優(yōu)化

復(fù)合蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交試驗(yàn)因素水平表如表5所示。

復(fù)合蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 復(fù)合蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交試驗(yàn)因素水平表

表6 復(fù)合蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析表

在直觀分析表中，由極差分析可知，在水解過程中四種因素對(duì)水解度的影響依次為：B（酶解pH）＞A（加酶量）＞C（酶解時(shí)間）。根據(jù)極差分析確定水解工藝最優(yōu)組合為A3B2C3，而9組正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合是A3B3C2，對(duì)2組試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證和比較，A3B2C3水解度為33.6%，比A3B3C2的26.95%大，因此選擇A3B2C3為最優(yōu)酶解工藝組合，即加酶量3.0%、pH 9.0、酶解時(shí)間3.5 h。由方差分析表可知，酶解pH對(duì)酶解豌豆蛋白影響顯著（p＜0.05），加酶量和酶解時(shí)間對(duì)水解豌豆蛋白影響不顯著。

2.4 雙酶水解順序?qū)ν愣闺乃舛鹊挠绊?/h3>

雙酶水解過程中不同的酶解順序可能會(huì)對(duì)酶解效果有影響，因此用2種酶先后對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行酶解。

研究A酶和P酶酶解順序?qū)ν愣沟鞍姿舛鹊挠绊懀Y(jié)果見表8。

最佳酶解順序?yàn)镻→A，在此條件下得到水解度為39.61%。P→A的水解度大于A→P的水解度原因可能是P酶酶解豌豆蛋白暴露出來的位點(diǎn)有利于A酶的酶解，但A酶酶解豌豆蛋白暴露出來的位點(diǎn)不利于P酶的酶解，兩者之間存在位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)。

2.5 豌豆肽的抗氧化活性測(cè)定試驗(yàn)

制備單酶、雙酶酶解豌豆蛋白水解物，研究其抗氧化活性。

由表9可知，豌豆蛋白水解物對(duì)Fe2+螯合能力在一定范圍內(nèi)隨樣品蛋白濃度增大而增大。對(duì)于A酶，樣品溶液質(zhì)量濃度從0.050 mg/mL增加到0.125 mg/mL時(shí)，F(xiàn)e2+螯合能力從7.85%增大到40.10%，對(duì)于P酶，樣品溶液質(zhì)量濃度從0.050 mg/mL增加到0.125 mg/mL時(shí)，其Fe2+螯合能力從12.93%增加到59.15%，對(duì)于P→A組，即雙酶水解組，其對(duì)Fe2+螯合能力在樣品溶液蛋白質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL時(shí)達(dá)到83.22%，是A酶組的2.08倍，是P酶組的1.41倍。綜上所述，雙酶水解豌豆蛋白獲得的水解物其抗氧化活性與單酶水解相比有顯著提高，這可能是由于雙酶水解能增加蛋白酶的催化位點(diǎn)，使更多小分子游離多肽釋放出來，而具有活性的多肽主要集中在小分子多肽中[13]，從而使雙酶水解得到的產(chǎn)物具有更高的抗氧化活性，這與杜鵑等、胡二坤等[14-15]的研究結(jié)果一致。

表8 雙酶水解順序?qū)ν愣沟鞍姿舛鹊挠绊?/p>

表9 不同酶解條件下豌豆蛋白水解物對(duì)Fe2+螯合能力的影響 %

3 結(jié)論

以水解度為指標(biāo)，優(yōu)化出雙酶水解豌豆蛋白的最佳酶解工藝為：底物濃度10%，在復(fù)合蛋白酶加酶量3.0%，pH 9.0，溫度55℃條件下酶解3.5 h；在堿性蛋白酶在加酶量3.0%，pH 9.5，溫度50℃條件下酶解4.0 h。在此最佳工藝條件下酶解其水解度為39.61%，水解液蛋白質(zhì)量濃度0.125 mg/mL時(shí)，對(duì)Fe2+螯合能力為83.22%，雙酶水解工藝可顯著提高豌豆蛋白的水解度和抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果為充分利用豌豆蛋白提供新思路，為豌豆肽在保健食品等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，從而提高豌豆附加值和擴(kuò)大應(yīng)用范圍。