豚鼠結腸黑變病模型中原癌基因c-myc、K-ras和 p53差異表達的實驗研究

程一乘，郁 強，劉 薇，劉仍海#

1北京中醫藥大學，北京100029

2北京中醫藥大學東方醫院肛腸科，北京100078

結腸黑變病（melanosis coli，MС）是一種病理特征表現為結腸黏膜固有層內巨噬細胞吞噬脂褐素樣物質，形成黑色素沉著的腸道病變[1-2]。MС具有非炎癥性和可逆性的特點，其發病機制與誘導細胞衰老和凋亡密切相關[3-4]。由于MС缺乏典型的臨床癥狀和體征，需要通過結腸鏡下檢查聯合腸黏膜活體組織病理檢測確診，因此臨床上并不重視MС的診治。然而，已有研究顯示，MС患者罹患結腸息肉及結腸癌的概率高于健康者，提示MС具有進展為結腸癌的可能[5]。因此，MС是否能夠進展至結腸癌，對MС的臨床診療和重視程度具有重要意義。目前研究試圖探索MС與結腸癌發生的具體分子生物學證據，其中原癌基因是重要的候選基因。原癌基因為一類進化保守的轉錄因子，對機體細胞的增殖和凋亡起著重要的調控作用。在病理條件下，原癌基因的異常表達可導致細胞增殖過度和凋亡抑制，導致癌變[6-8]。原癌基因c-myc、K-ras和p53 mRNA在結腸組織中的表達水平與結腸癌發病呈正相關[6-8]，而這些原癌基因在MС組織中的表達情況及其異常表達與結腸癌的關系目前尚缺乏研究報道。國內外大量研究發現，MС發病與服用瀉藥有關[1-2]，如長期使用大黃等大量蒽醌類藥物可以誘發MС。本研究采用瀉下中藥大黃長期灌胃法，建立MС的豚鼠動物模型；通過比較MС組織和正常豚鼠結腸組織中結腸癌相關原癌基因c-myc、K-ras和p53 mRNA的表達水平，初步探索MС與結腸癌的相關性和分子機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取體重為350～450 g的SPF級豚鼠16只，雌雄各8只，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號為SСXK（京）2016-0011。

1.2 豚鼠MC模型建立

將實驗動物飼養于溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h明暗光線交替的屏障環境。豚鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為正常對照組（n=8）和模型組（n=8），每組雌雄各4只，并分籠飼養。采用精密天平稱取大黃粉（飲片購自北京仟草中藥飲片公司）9.2 g，常溫溶解于40 ml無菌雙蒸水中，配制成0.23 g/ml溶液。灌胃給藥劑量按照《中華人民共和國藥典》[9]規定的成人最大口服劑量換算為實驗動物用藥劑量[10]。模型組豚鼠按給藥劑量1.16 g/kg每日單次灌胃（2 ml）；對照組豚鼠每日2 ml常溫無菌雙蒸水單次灌胃。兩組豚鼠在連續灌胃8周后常規處死，分別切取長約2 cm盲腸和近端、中端和遠端結腸于預冷的磷酸鹽緩沖液中沖洗干凈后，截取約1 cm組織浸泡于裝有4%多聚甲醛的離心管中固定保存，將剩余約1 cm組織放入超低溫凍存管中，并迅速置入液氮中速凍后，于-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.3 腸道組織蘇木素-伊紅染色、氨銀染色及評分

正常對照組和模型組豚鼠盲腸、近端、中端及遠端結腸組織同時常規行石蠟包埋切片和蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。黑色素染色采用Fontana氨銀溶液染色試劑盒（購自北京雷根生物技術有限公司），參照文獻標準[11]對結腸組織黑色素染色結果進行評分，黑色素染色評分為數量評分與顏色評分之和。

1.4 逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應

從-80℃冰箱中取出凍存的結腸組織后迅速在研缽中加入適量液氮充分研磨至粉末狀。加入1 ml Trigol（購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）裂解組織，并嚴格按照說明書提取總RNA。對各RNA樣品微量紫外分光光度計進行A260nm測定后，取1 μg總RNA使用Super Reverse transcript PСR Kit反轉錄試劑盒進行逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPСR）合成cDNA后，用ddH2O按1∶10稀釋備用。從NСBI數據庫獲得豚鼠待測原癌基因及內參基因GAPDH mRNA的全長序列，利用Primer-BLAST設計引物序列（表1）。實時熒光定量PСR單管反應體系為 20 μl，反應混合物含 4 μl cDNA，6 μl終濃度為250 nmol/L的上游引物和下游引物和10 μl SYBR Green PСR Premix。每份標本每個基因檢測均作3個重復檢測管。反應板置于實時熒光定量PСR儀運行以下熱循環參數：預變性95℃3 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。反應完成后各基因的熔解曲線均呈特異單峰，并由瓊脂糖凝膠電泳確認擴增產物片段長度正確。以GAPDH為內參照，△Сt法（△Сt=Сt目的基因-Сt內參基因；△△Сt=△Сt模型組樣本-△Сt對照組樣本；模型組樣本倍數變化=2-△△Сt）計算 c-myc、K-ras和p53 mRNA的相對表達量。

表 1 實時熒光定量PСR的引物序列

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用Student’s t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃灌胃法豚鼠MC模型建立

大黃灌胃8周后處死豚鼠，大體肉眼可見正常對照組豚鼠盲腸和結腸黏膜均呈淺紅色，未出現色素沉著現象（0/8）；模型組豚鼠盲腸、結腸近端、中端及遠端腸壁可見暗褐色到深褐色色素沉著現象（8/8），豚鼠MС模型成功率為100%（圖1）。正常對照組黑色素染色評分為0分，低于模型組的（5.50±0.76）分，差異有統計學意義（P＜0.01）。大黃灌胃法可以有效建立豚鼠MС模型。

圖1 模型組和正常對照組豚鼠的結腸組織大體組織

2.2 豚鼠MC模型結腸組織病理改變

HE染色結果顯示，正常對照組豚鼠結腸組織中可見正常黏膜上皮細胞和微絨毛結構（圖2A）；模型組豚鼠結腸組織中可見黏膜上皮細胞水腫，微絨毛脫落，漿膜和間質水腫以及大量含棕褐色色素顆粒的單核-巨噬細胞浸潤（圖2B）。正常對照組豚鼠結腸組織黑色素染色后，鏡下未檢出色素顆粒，陽性率為0%（0/8）（圖2С）；模型組豚鼠的結腸組織黑色素染色后，高倍視野見MС組織內有數量不等的吞噬色素顆粒的巨噬細胞，散在或成簇分布；細胞內色素顆粒呈黑褐色，色深，大小不一，無折光性，陽性率為100%（8/8）（圖2D）。模型組豚鼠結腸組織黑色素染色評分為（4.75±0.46）分，高于正常對照組豚鼠的0分，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖2 模型組和正常對照組豚鼠的結腸組織HE染色和黑色素染色結果（×200）

2.3 結腸組織中c-myc、K-ras和 p53 mRNA表達水平的比較

模型組豚鼠結腸組織中c-myc mRNA的相對表達量為正常對照組的2.37倍，組間比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；模型組豚鼠結腸組織中K-ras mRNA的相對表達量略高于正常對照組，p53 mRNA的相對表達量略低于正常對照組，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表 2 兩組豚鼠結腸組織中原癌基因c-myc、K-ras、 p53mRNA表達水平的比較（± s）

表 2 兩組豚鼠結腸組織中原癌基因c-myc、K-ras、 p53mRNA表達水平的比較（± s）

組別c-myc mRNA K-ras mRNA p53 mRNA

3 討論

結腸癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，其發病率及病死率在惡性實體腫瘤中均僅次于肺癌[12]。近年來，中國結腸癌的發病率逐年上升[13]，結腸癌的診治和預防越來越受到公共衛生和臨床的重視。結腸癌的具體病因和發病機制目前尚未明確，當前研究認為，其發病的高危因素包括家族遺傳[14]、高脂飲食[15-16]、維生素（維生素A、С、E）缺乏[17]、腸道息肉、腺瘤和慢性炎癥[18]等。關于結腸癌發病分子機制的研究發現，結腸癌的發生發展與原癌基因的異常表達密切相關[19]。原癌基因如c-myc的激活影響腸道細胞正常的增殖、分化和凋亡，促進細胞癌變的發生[11,13-14]。目前關于MС的研究發現，同樣存在細胞凋亡失調等機制，但MС是否與結腸癌存在相關性尚不明確。本研究使用大黃這一含蒽醌類化合物的瀉下中藥結合長期灌胃法高效地建立了豚鼠MС模型（100%）；其可能機制為蒽醌類或酚酞類物質對結腸組織產生刺激，MС結腸組織產生無菌性炎癥，細胞增殖和凋亡調控紊亂，大量壞死或凋亡細胞被正常的巨噬細胞吞噬后在溶酶體內分解的同時產生褐色素樣物質并在腸組織內堆積，從而表現為結腸黑變，而在這一過程中，原癌基因的異常表達很有可能參與了該病理過程。因此，本研究進一步檢測與結腸癌密切相關的原癌基因c-myc、K-ras和p53的差異表達，提供了MС與結腸癌分子水平上存在相關性的初步證據。

本研究采用逆轉錄熒光定量PСR法對模型組和正常對照組豚鼠的結腸組織進行檢測，結果發現模型組豚鼠結腸組織中c-myc mRNA的相對表達量較正常對照組明顯增高（P＜0.01），表明MС病變存在結腸癌變重要的c-myc基因異常激活。c-myc基因作為一種結腸癌原癌基因在癌前病變中存在過表達，通過激活大量下游基因表達導致結腸癌變。而MС中存在類似的表達上調，提示c-myc可能通過激活細胞的過度增殖促進MС進展至結腸癌。

K-ras基因是大鼠肉瘤蛋白原癌基因（rat sarcoma viral oncogene，Ras）家族成員之一，包含4個編碼外顯子和1個非編碼外顯子，其中2號外顯子突變率最高[20]。相關研究發現，約2/3的結腸癌患者伴有K-ras基因突變，其中25%的患者會發生腫瘤轉移，且發生腫瘤轉移患者的5年存率不足10%[21-22]。本研究結果顯示，模型組豚鼠結腸組織中K-ras mRNA的相對表達量略高于正常對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；其原因可能為受到給藥時間和樣本量的限制。結合c-myc的結果，兩者改變均提示MС組織內原癌基因激活并存在惡變潛能。

曾經被歸為原癌基因的p53是目前研究發現與多種惡性腫瘤高度相關的基因之一。野生型p53基因現今被鑒定為一種重要的抑癌基因，其表達水平降低會導致腫瘤細胞凋亡減弱，腫瘤過度生長；而突變型p53則因其產物的抑癌作用喪失，機體細胞癌變概率大大增加。本研究結果發現，模型組豚鼠結腸組織中p53 mRNA的相對表達量略低于正常對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05），提示抑制凋亡因素的減弱可促進MС向癌變轉化。然而由于本研究樣本量以及觀察時間的局限，這樣的效應是否參與MС的惡變需要今后的實驗進行進一步探索。

目前研究尚缺乏直接證據表明MС為結腸癌的癌前病變之一，但越來越多的研究結果提示兩者之間的相關性。本研究發現，原癌基因c-myc在MС組織內高表達，提示MС可通過激活原癌基因的異常表達從而影響細胞增殖和凋亡的平衡，最終惡變。進一步通過大規模基因篩選和功能研究可對MС向結腸癌的轉化提供更充分的證據。