人源性腫瘤異種移植模型成瘤率影響因素的研究進(jìn)展△

王月霞，吳曉林，秦賢舉

江蘇大學(xué)附屬上海市第八人民醫(yī)院胃腸外科，上海200235

腫瘤動(dòng)物模型是腫瘤研究的重要工具，特別是將手術(shù)中獲得的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠使之成瘤的人源性腫瘤異種移植模型（patientderived human tumor xenograft models，PDX），彌補(bǔ)了傳統(tǒng)體內(nèi)模型喪失腫瘤微環(huán)境及原始腫瘤異質(zhì)性的缺陷[1-4]。但PDX的平均移植成瘤率僅約為25%[5]，且各類腫瘤的成瘤率不等（23%～75%）[6]，因而限制了該模型的廣泛應(yīng)用。在這種類似于種植的建模操作中，腫瘤移植物、異種移植宿主及移植操作均是影響建模率的關(guān)鍵因素，本文針對(duì)上述3個(gè)方面就影響PDX成瘤率的因素作一綜述。

1 移植物的特性及質(zhì)量

1.1 移植物本身的特性

多種基于PDX的研究表明，接種病理分期較晚或轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本的建模成瘤率更高[7-8]。但是，與其他腫瘤不同，胃癌的成瘤率與腫瘤的侵襲性及惡性程度無(wú)關(guān)[9-10]，這可能是因?yàn)槲赴┑漠愘|(zhì)性高于其他腫瘤。目前，腫瘤患者在術(shù)前是否接受放化療、腫瘤組織的病理類型及腫瘤標(biāo)志物水平等對(duì)成瘤的影響尚存在爭(zhēng)議；Fichtner等[2]在非小細(xì)胞肺癌建模中發(fā)現(xiàn)，病理類型、年齡、性別、吸煙史、術(shù)前是否放化療等與建模成瘤率無(wú)關(guān)；而Marangoni等[8]在乳腺癌建模中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)管癌的建模成瘤率高于小葉癌，移植物來(lái)源的患者機(jī)體激素或受體水平與分泌相關(guān)性腫瘤的成瘤率密切相關(guān)，如雌激素受體（estrogen receptor，ER）陰性乳腺癌的成瘤率高于ER陽(yáng)性乳腺癌。

1.2 移植物的質(zhì)量

高質(zhì)量的腫瘤移植物是種植的關(guān)鍵，且相對(duì)于移植物本身的特性，樣本質(zhì)量在一定程度上能夠通過(guò)更嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的操作來(lái)提高。移植物中腫瘤細(xì)胞數(shù)量及移植物熱缺血時(shí)間是影響樣本質(zhì)量的兩個(gè)關(guān)鍵因素。

Сhou等[4]注射到成功建立結(jié)直腸癌模型小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞明顯高于失敗組；彌散型胃癌建模較難成瘤是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞分散在基質(zhì)組織中，在移植相同體積或數(shù)量的組織時(shí)，單位面積腫瘤細(xì)胞比例明顯少于其他類型腫瘤[10]。因此，瘤源在移植前不僅需要去除壞死或被感染的細(xì)胞組織以避免動(dòng)物因感染死亡，而且還需要確保移植物中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和比例，如Julien等[7]僅選取腫瘤細(xì)胞比例超過(guò)40%的樣本用于后續(xù)建模。

此外，樣本熱缺血時(shí)間對(duì)成瘤也有顯著影響，熱缺血時(shí)間是指細(xì)胞、組織或器官?gòu)墓w供血停止到冷灌注開始的這段時(shí)間。已有研究表明，縮短胃癌標(biāo)本平均離體時(shí)間及建模操作時(shí)間可以明顯提高建模成瘤率[10]，究其原因可能為離體組織血流中斷后仍可以繼續(xù)代謝，而堆積的代謝產(chǎn)物會(huì)影響成瘤。因此，在手術(shù)或活檢后應(yīng)快速建模或冰凍樣本以縮短樣本熱缺血時(shí)間，而相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明新鮮組織和冰凍組織的成瘤率并無(wú)明顯差別[7,11]。

2 宿主的品系及特點(diǎn)

自Rygaard首次成功在裸鼠體內(nèi)移植人源性腫瘤以來(lái)，免疫缺陷小鼠憑借其已知遺傳信息、繁殖速度極快、解剖結(jié)構(gòu)和基因組結(jié)構(gòu)與人體極為相似且對(duì)移植物排斥反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)成為腫瘤種植的最佳異種移植宿主。

動(dòng)物存在免疫缺陷但卻并非沒(méi)有免疫力，其體內(nèi)殘存的免疫細(xì)胞對(duì)移植物的篩選及排斥作用明顯影響成瘤效果，因而應(yīng)用免疫缺陷度更高的小鼠品系代替裸鼠可以明顯提高建模成瘤率[10,12]。但宿主免疫力過(guò)低會(huì)導(dǎo)致死亡率增高[13]，且免疫缺陷程度更高的NOD/SСID及NOG品系在建模中易發(fā)生人源性淋巴瘤，這在肝癌[14]、非小細(xì)胞肺癌[15]、腸癌[16]等腫瘤建模中均有報(bào)道，尤其常見于胃癌[10,17]建模中；究其原因可能是因?yàn)槲赴┗颊咄ǔ０橛杏拈T螺旋桿菌感染，移植后在無(wú)免疫監(jiān)視的小鼠體內(nèi)激活擴(kuò)增，進(jìn)而刺激人源性B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性增殖狀態(tài)[17]，這提示裸鼠可能更適宜作為胃癌PDX模型的接種對(duì)象。

此外，部分激素依賴性腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌等，還需要考慮小鼠的性別和激素水平，如在乳腺癌建模中給雌鼠補(bǔ)充雌激素是提高成瘤率的有效方法[18]。鼠齡也是影響成瘤的一個(gè)因素，與年幼（3周齡）或新生鼠相比，成年鼠（6～8周齡）更易成瘤及轉(zhuǎn)移，這可能與不同年齡小鼠中NK細(xì)胞的活性有關(guān)[19]。上述研究顯示，最佳移植宿主的選擇應(yīng)根據(jù)腫瘤類型、操作要求等具體分析，綜合考慮。

3 移植的方法及部位

3.1 移植的形式及方式

根據(jù)腫瘤類型及研究目的，可以將移植物以組織塊或細(xì)胞懸液的形式接種到小鼠體內(nèi)，實(shí)體瘤通常以組織塊的形式接種，而血液惡性腫瘤以細(xì)胞懸液的形式注射。同時(shí)，也可根據(jù)研究目的將實(shí)體瘤制備成細(xì)胞懸液注射到鼠尾靜脈，以模擬腫瘤血道轉(zhuǎn)移；或通過(guò)細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物分選單類細(xì)胞，再注射到小鼠體內(nèi)以探究各類細(xì)胞的功能等。Al-Hajj等[20]將從乳腺癌患者惡性胸腔積液中分類出的人上皮特異性抗原（epithelial specific antigen，ESA）陽(yáng)性細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)，隨后發(fā)現(xiàn)了乳腺癌腫瘤干細(xì)胞。

同一組織塊的接種方式對(duì)成瘤率也有一定影響。直接縫合能夠從整體上觀察成瘤，是一種可靠有效的觀察模型；醫(yī)用膠粘手術(shù)難度小，操作時(shí)間短，且吻合度好，也避免了因扎到腸壁血管而造成腸壞死的缺點(diǎn)，降低了手術(shù)死亡風(fēng)險(xiǎn)[21]；用穿刺針穿刺后以擴(kuò)大針眼的方式代替皮膚切開，不僅縮短建模時(shí)間，還減少了腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中小鼠搔抓破裂的概率[22]。同樣，細(xì)胞懸液濃度、混勻液體種類及細(xì)胞懸液中細(xì)胞狀態(tài)對(duì)成瘤率也有明顯影響。每點(diǎn)注射細(xì)胞越多，越易成瘤，但高濃度懸液會(huì)給實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)較大難度[18]，這就需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整懸液濃度，保證在較順利的操作下盡可能提高成瘤率；混勻液體的選擇取決于研究的目的，如選擇鼠尾膠可以增加細(xì)胞間黏附，應(yīng)用基質(zhì)膠可以使移植物免于局部免疫效應(yīng)細(xì)胞的攻擊[23]；懸液中細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)成瘤的影響相對(duì)關(guān)鍵：細(xì)胞簇比單細(xì)胞懸液更易成瘤并明顯增加腫瘤的轉(zhuǎn)移能力[23-24]。

3.2 移植部位

根據(jù)瘤源在小鼠體內(nèi)接種部位的不同，可以將移植模型分為異位和原位移植模型。皮下移植是異位移植最常見的部位，也是較大規(guī)模接種的首選方式。研究表明，多種腫瘤的皮下移植成瘤率高于其他部位[4,8,10]，且皮下成瘤的體積更大、小鼠早期的發(fā)病率及病死率也更低。腎包膜下因其良好的血供及獨(dú)特的流體動(dòng)力學(xué)為異位移植提供了新思路。Lin等[25]在腎包膜下建立的前列腺癌PDX模型的成瘤率達(dá)94%，且可連續(xù)傳代培養(yǎng)。然而，任何部位的異位移植都改變了腫瘤生物學(xué)行為和自然屬性，因而應(yīng)盡可能地建立更接近人體的腫瘤生長(zhǎng)模式的原位移植模型，但這也對(duì)操作技術(shù)、研究經(jīng)費(fèi)、觀測(cè)手段等有著更高的要求。

移植部位的選擇應(yīng)根據(jù)腫瘤類型、研究目的及操作條件等綜合考慮，使各部位接種優(yōu)點(diǎn)最大化。即使同為原位或異位移植，移植部位稍有差異也可能影響成瘤，如結(jié)直腸癌標(biāo)本原位移植到遠(yuǎn)端、近端結(jié)腸及直腸的成瘤也不同[7]；同為皮下接種，移植到近頭側(cè)的成功率更高，接種到腋窩等皮膚松弛部位能使腫瘤長(zhǎng)的更大[19]。針對(duì)同種腫瘤，若研究腫瘤免疫遺傳或抗腫瘤藥物的初步篩選，可以選擇成瘤率更高的異位移植模型；若研究腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，則應(yīng)盡可能地建立與人體更接近的原位移植模型。

4 小結(jié)

PDX模型成瘤率是多因素共同作用的結(jié)果，除上述幾個(gè)報(bào)道較多、認(rèn)識(shí)較明確的因素外，可能有部分原因尚未明確，這就需要研究人員在基于PDX模型的研究中全面綜合分析，使影響成瘤率的各個(gè)因素達(dá)到最佳組合，并在實(shí)驗(yàn)中不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，盡力探究更多未知的影響因素，使腫瘤模型取得更理想的成瘤率，進(jìn)而基于模型開展后續(xù)研究。此外，還要熟練掌握實(shí)驗(yàn)技術(shù)，關(guān)注免疫缺陷動(dòng)物學(xué)發(fā)展，減少操作引起的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。

除成瘤率低外，成本高、建模時(shí)間長(zhǎng)，移植物中人源性基質(zhì)隨傳代會(huì)逐漸丟失等缺點(diǎn)也限制了該模型的廣泛應(yīng)用。但這也為生命學(xué)科的研究者提供了新方向與新挑戰(zhàn)，從而不斷完善改進(jìn)建模技術(shù)，爭(zhēng)取在腫瘤研究領(lǐng)域建立PDX模型數(shù)據(jù)庫(kù)，將患者特征、腫瘤特點(diǎn)、分子結(jié)構(gòu)、藥理反應(yīng)等與動(dòng)物模型互聯(lián)，為高度復(fù)雜多樣的腫瘤建立更細(xì)化的分層，最大程度凸顯腫瘤異質(zhì)性。從而在短時(shí)間內(nèi)高效搜索，為每例患者尋找最適合的個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療。