拓撲替康對非小細胞肺癌荷瘤小鼠存活和腫瘤細胞轉移的影響及相關機制

王總飛，楊慧遠，劉先本#，張瑞祥，劉士磊

鄭州大學附屬腫瘤醫院1胸外科，2放射科，鄭州450008

肺癌是常見的肺部惡性腫瘤，在中國的發病率和病死率均居第1位[1]。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占全部肺癌的80%以上[2]。在非小細胞肺癌中，肺腺癌的比例逐年升高，其病情發展迅速，轉移速度快，大部分患者在診斷時已發展至中晚期。盡管近年來分子靶向治療及免疫治療取得了令人矚目的成績，但化療仍然是治療非小細胞肺癌的重要方法之一[3-4]。肺腺癌是臨床治療的難點，為延長患者的生存時間和提升治療效果，尋找新的有效的治療方法和藥物具有重要意義。拓撲替康（topotecan，TPT）是半合成的喜樹堿類衍生物，是拓撲異構酶Ⅰ抑制劑，與拓撲異構酶Ⅰ和DNA形成三元復合物，阻礙斷裂的DNA單鏈重新修復。與其他喜樹堿類抗腫瘤藥物相比，TPT具有較廣的抗腫瘤活性和較低的毒性[5]。TPT目前主要用于非小細胞肺癌的三線以上治療，具體作用機制有待進一步研究。本研究通過建立非小細胞肺癌裸鼠模型，研究TPT對腫瘤細胞生長、凋亡、轉移及荷瘤裸鼠存活的影響及潛在的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

TPT購自南京凱基生物科技發展有限公司，胎牛血清、DMEM培養基和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，TUNEL染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，兔抗人Ki-67、裂解型胱天蛋白酶3（caspase 3）、血管內皮生長因子С（vascular endothelial growth factor С，VEGFС）和基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗體均購自美國СST公司，小鼠胱抑素С酶聯免疫吸附測定試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

人非小細胞肺癌細胞H1993購自美國模式菌種收集中心，將其接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養條件為5%СO2、37℃。

1.3 實驗動物分組及給藥方法

雄性裸鼠（體重為18～22 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。常規培養H1993細胞，待細胞融合度達到80%～90%時，加0.25%胰蛋白酶消化呈單細胞懸液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸并調整細胞密度為1×107/ml。每只裸鼠右側腋皮下接種0.2 ml細胞懸液，當腫瘤體積生長至約100 mm3時，將造模成功的裸鼠隨機分為4組：對照組、TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組，每組20只。以分組后為第1天，TPT低、中、高劑量組分別灌胃0.5、1.0、1.5 mg/kg TPT，對照組灌胃等量生理鹽水，連續灌胃30天。

1.4 腫瘤體積測量

應用游標卡尺每隔5天測量腫瘤長軸（a）和與長軸垂直的寬度（b），按照公式腫瘤體積（V）=0.35×（a×b）3/2計算。

1.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡

用藥30天后，剝離腫瘤組織。取部分組織置于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟切片。組織切片用二甲苯洗2次，每次5 min，梯度乙醇至水洗，加蛋白酶K于室溫下作用15 min，蒸餾水洗。2%過氧化氫室溫下反應5 min，PBS洗2次；加TdT酶緩沖液，吸水紙吸去多余液體，加TdT酶反應液，濕盒中37℃避光反應1 h；室溫下終止反應，PBS洗3次，加過氧化物酶標記的地高辛抗體，濕盒中室溫反應30 min，PBS洗3次；加新鮮配制的二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，室溫顯色5 min，蒸餾水洗后復染；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro plus軟件分析凋亡細胞。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白表達

取裸鼠腫瘤組織，預冷PBS洗滌后，在液氮中研磨，加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，15 000 r/min離心10 min，上清即為細胞總蛋白，BСA法檢測蛋白濃度，加上樣緩沖液制作蛋白樣品。取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，換一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后加電化學發光液顯影。采用Image-Pro plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度。

1.7 酶聯免疫吸附試驗檢測胱抑素 C濃度

取0.1 ml稀釋后的抗體至反應孔中，4℃過夜，棄去孔中溶液后應用緩沖液沖洗3次；取0.1 ml待檢測樣品至包被后的孔中，設置空白對照，37℃孵育1 h，緩沖液洗滌；加0.1 ml酶標抗體，37℃孵育30 min，緩沖液洗滌；加底物37℃反應20 min后，終止反應；酶標儀中檢測波長為450 nm處的光吸收值，計算胱抑素С的濃度。

1.8 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 存活率的比較

對照組荷瘤小鼠在第9天開始出現死亡，第24天后存活率趨于平穩。對照組死亡9只，TPT低劑量組死亡6只，TPT中劑量組死亡3只，TPT高劑量組死亡2只。第30天時，TPT高劑量組、TPT中劑量組、TPT低劑量組荷瘤裸鼠的存活率分別為90%、85%、70%，均高于對照組的55%。

2.2 腫瘤體積的比較

隨著時間延長，各組腫瘤均有所增長，但TPT用藥濃度越高，體積增長越慢。（表1）

2.3 細胞凋亡率的比較

TPT作用30天后，腫瘤組織中凋亡細胞數目明顯增加，且隨著TPT濃度的增加，效果明顯增加（圖1）。TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組的細胞凋亡率分別為（12.15±0.48）%、（32.67±0.51）%、（51.12±0.64）%，均高于對照組的（5.03±0.23）%，差異均有統計學意義（t=5.38、14.52、32.67，P＜0.05）。

表 1 各組非小細胞肺癌模型鼠的腫瘤體積（mm 3，±s）

表 1 各組非小細胞肺癌模型鼠的腫瘤體積（mm 3，±s）

注：*與同時間點對照組比較，P＜0.05

組別第1天第5天第10天第15天第20天第25天第30天

圖1 TUNEL染色檢測腫瘤細胞凋亡（TUNEL染色，×400）

2.4 細胞增殖、凋亡相關蛋白表達水平的比較

TPT作用30天后，Ki-67表達水平降低，caspase 3表達水平升高，且TPT濃度越高，效果越明顯（圖2）。TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組中Ki-67/GAPDH分別為（0.96±0.09）、（0.65±0.05）、（0.38±0.04），均低于對照組的（1.42±0.12），差異均有統計學意義（t=11.26、32.57、68.96，P＜0.05）；TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組中caspase 3/GAPDH分 別 為（0.59±0.06）、（0.95±0.08）、（1.36±0.13），均 高 于 對 照 組 的（0.32±0.05），差異均有統計學意義（t=6.24、29.58、71.25，P＜0.05）。

圖2 Westernblot檢測腫瘤組織中Ki-67和caspase 3蛋白表達

2.5 腫瘤遷移相關蛋白表達水平的比較

TPT作用30天后，腫瘤組織中VEGFС和MMP2的表達水平均降低，且隨著TPT用藥濃度的增加，效果明顯增加（圖3）。TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組中VEGFС/GAPDH分別為（0.89±0.09）、（0.61±0.05）、（0.32±0.04），均低于對照組的（1.29±0.12），差異均有統計學意義（t=9.64、23.87、48.98，P＜0.05）；TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組中MMP2/GAPDH分別為（0.97±0.06）、（0.72±0.08）、（0.39±0.05），均低于對照組的（1.41±0.13），差異均有統計學意義（t=10.36、29.43、63.55，P＜0.05）。

圖3 Westernblot檢測腫瘤組織中VEGFС和MMP 2蛋白表達

2.6 胱抑素C濃度的比較

TPT作用30天后，TPT低劑量組、TPT中劑量組和TPT高劑量組的胱抑素С濃度分別為（431.10±42.59）、（365.37±38.64）、（296.84±32.58）μg/ml，均低于對照組的（532.22±51.34）μg/ml，差異均有統計學意義（t=6.58、16.31、24.56，P＜0.05）。

3 討論

肺癌是發病率和病死率均較高的惡性腫瘤。據統計，2015年約有190萬新發肺癌病例，約有170萬人因肺癌死亡，且肺癌患者的數量呈逐年增加的趨勢[6]。肺癌患者在確診時多數處于晚期，其中非小細胞肺癌對放療和化療均不敏感，靶向藥物治療容易出現耐藥性；即使診斷時處于早期，仍有約40%的患者出現復發，患者的5年生存率很低。TPT具有較強的抗腫瘤活性和廣譜抗腫瘤作用，研究顯示，TPT對乳腺癌、小細胞肺癌和宮頸癌等移植瘤有明顯的抗癌作用[7]。TPT目前主要用于非小細胞肺癌的三線以上治療，其具體機制有待進一步研究[8]。

本研究采用皮下注射的方式建立非小細胞肺癌移植瘤裸鼠模型，當腫瘤生長至約100 mm3時對荷瘤裸鼠用藥，檢測腫瘤體積，記錄荷瘤裸鼠的存活率。結果顯示，TPT作用后裸鼠的存活率高于對照組，腫瘤體積低于對照組。Ki-67是腫瘤細胞增殖能力的重要指標之一。Western blot結果顯示，TPT作用后非小細胞肺癌模型鼠腫瘤組織中Ki-67的表達水平降低，表明TPT可以抑制非小細胞肺癌模型鼠腫瘤細胞的增殖。

細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內在遺傳機制的控制自動結束生命的過程，在機體生長發育和維持機體平衡方面起著重要作用。腫瘤細胞中細胞凋亡處于抑制狀態，大量抗腫瘤藥物通過各種途徑誘導腫瘤細胞凋亡，如牡荊素通過線粒體通路和磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）信號通路誘導人非小細胞肺癌A549細胞凋亡，非瑟酮通過抑制促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路誘導非小細胞肺癌細胞凋亡和內質網應激[9-10]。本研究結果顯示，TPT作用后，非小細胞肺癌模型鼠腫瘤細胞凋亡率增加。胱天蛋白酶（caspase）家族是細胞凋亡過程中的關鍵酶，其中caspase 3處于凋亡級聯反應的下游，是caspase家族中重要的細胞凋亡執行者。Western blot結果顯示，TPT作用后，腫瘤組織中活化的caspase 3的表達水平升高。Zhang等[11]研究發現，TPT可以抑制神經膠質瘤細胞和神經膠質瘤干細胞的生長并誘導細胞凋亡。Bruzzese等[12]研究發現，TPT通過產生活性氧和DNA損傷誘發的細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。在腫瘤細胞中，拓撲異構酶Ⅰ的含量及活性均顯著高于正常細胞。因而，大量的抗腫瘤藥物以拓撲異構酶為靶點，抑制腫瘤細胞的快速增殖。TPT與拓撲異構酶Ⅰ和DNA單鏈形成三元復合物，造成DNA損傷和細胞周期阻滯[13]。當細胞DNA損傷嚴重時，啟動細胞凋亡機制，使細胞進入程序化死亡。

本研究結果顯示，不同濃度TPT作用后，裸鼠腫瘤組織中VEGFС與MMP2的表達水平均降低。腫瘤的侵襲和轉移是連續的多步驟過程，其中細胞外基質的降解和腫瘤微血管的形成在腫瘤轉移灶的形成過程中必不可少。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能夠特異性刺激血管內皮細胞的分裂與增殖，促進血管生成。VEGFС是VEGF家族中的一員，可以促進腫瘤間質血管網形成和淋巴管生成。在非小細胞肺癌中，VEGFС可作為腫瘤細胞轉移的重要標志，且其表達水平與非小細胞肺癌患者預后密切相關[14-15]。MMP2能夠降解細胞外基質中最豐富的Ⅳ型膠原蛋白。基底膜可以為細胞提供結構支持，維持組織穩定，影響細胞的信號傳遞和極性，基底膜破壞是大多數腫瘤轉移的關鍵步驟。研究表明，非小細胞肺癌組織中MMP2高表達[16]，抑制MMP2的表達能夠有效抑制非小細胞肺癌的侵襲和遷移[17]。Nakashio等[18]研究發現，TPT通過阻滯PI3K-AKT信號通路，抑制VEGF誘導的血管內皮細胞遷移。小鼠模型實驗發現，TPT具有抑制腫瘤血管生成的作用[19]。本研究結果顯示，TPT能夠有效降低非小細胞肺癌模型鼠腫瘤組織中VEGFС和MMP2的表達水平，表明TPT具有抑制腫瘤細胞轉移的能力，但具體的作用機制仍需進一步研究證實。

胱抑素С是有核細胞產生的一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，能夠抑制單核細胞的趨化作用進而參與機體的免疫應答。研究發現，胱抑素С與卵巢癌、乳腺癌和食管癌的發展密切相關[20]。Naumnik等[21]研究認為胱抑素С水平隨著肺癌分期的升高而升高。本研究采用酶聯免疫吸附試驗檢測非小細胞肺癌裸鼠血清中胱抑素С的濃度，結果顯示，TPT作用后，裸鼠血清中胱抑素С的濃度降低。

綜上所述，TPT可以抑制非小細胞肺癌轉移，提高荷瘤小鼠的存活率，其作用機制與抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡相關分子表達及降低胱抑素С水平有關。