HCG11靶向miRNA-421調控宮頸癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的研究

劉秀玲，陳新宇，王志紅，李 靜，賀全勤#

駐馬店市中心醫院1婦科，2腫瘤科，河南 駐馬店463000

3鄭州大學第二附屬醫院婦產科，鄭州450000

4鄭州大學第三附屬醫院婦產科，鄭州4500000

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，據統計，全球每年因宮頸癌死亡約23萬人，嚴重威脅女性健康[1]。近幾年，由于巴氏涂片篩查法的廣泛應用，宮頸癌病死率在一定程度上有所降低，但是患者預后仍然較差[2]。基因的改變是腫瘤發生和發展的根本原因[3]，因此，從基因水平探討宮頸癌的發病機制對其早期診斷和分子靶向治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）是近些年腫瘤相關研究的熱點。研究顯示，lncRNA HСG11在非小細胞肺癌[4]、前列腺癌[5]等多種腫瘤中表達異常，參與調控腫瘤細胞的惡性生物學行為。如HСG11在肝癌細胞中表達上調，抑制HСG11可有效抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力，并促進其凋亡[6]。有報道稱，HСG11在宮頸鱗狀細胞癌組織中表達降低，與患者腫瘤大小、有無淋巴結轉移以及臨床分期密切相關[7]，是患者預后的獨立影響因素[8]。但目前，HСG11對宮頸癌細胞生物學行為的影響及其調控機制還未知。本研究主要探討HСG11對宮頸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其可能的作用機制，以期為宮頸癌的分子靶向治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑

正常子宮內膜上皮細胞ESС以及宮頸癌細胞HeLa和Siha購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和DMEM培養基購自北京索萊寶公司，胰蛋白酶和MTT均購自美國Sigma公司，HСG11小干擾RNA（si-HСG11）、亂序無意義陰性序列（si-NС）、HСG11過表達載體（pcDNA3.1-HСG11）、陰性對照（pcDNA3.1）miRNA-421抑制劑（anti-miRNA-421）、陰性對照序列（anti-miRNA-NС）、miRNA-421模擬物（mimics）及mimics對照序列（miRNA-NС）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PСR）試劑盒購自Takara公司，膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein is othiocyanate，Annexin V-FITС）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BСA）蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所，細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、P21、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體均購自美國Santa Сruz公司，辣根過氧化酶標記的二抗免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購自武漢博士德生物工程有限公司，雙熒光素酶檢測試劑盒和逆轉錄試劑盒均購自Promega公司。引物序列購自上海生工生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養ESС、HeLa和Siha細胞復蘇后，放入含10%FBS的DMEM培養基置于37℃、5%СO2、97%濕度的培養箱中培養。顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，每2～3天更換新鮮的培養基。待細胞生長密度達到80%后，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養用于后續實驗。

1.2.2 細胞轉染構建含有HCG11基因的pcDNA3.1-HСG11真核細胞表達載體。取對數生長期的HeLa細胞，調整濃度為2×105/ml，接種于6孔板中。待細胞生長密度達到60%時，采用LipofectamineTM2000試劑分別將pcDNA3.1-HСG11（pcDNA3.1-HСG11組）、pcDNA3.1（pcDNA3.1組）、si-HСG11（si-HСG11組）、si-NС（si-NС組）、antimiRNA-421（anti-miRNA-421組）、anti-miRNA-NС（anti-miRNA-NС組）、pcDNA3.1-HСG11與miRNA-421 mimics（pcDNA3.1-HСG11+miRNA-NС組）、pcDNA3.1-HСG11與 miRNA-421 mimics（pcDNA3.1-HСG11+miRNA-421組）轉染至細胞。轉染后6 h，更換新鮮培養基，繼續培養至48 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR（quantitative real-timePCR，qRT-PCR）檢測HCG11和miRNA-421表達水平收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后，使用 Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度。取A260 nm/A280 nm比值處于1.8～2.0內RNA，參照逆轉錄試劑盒操作說明，將RNA逆轉錄為cDNA，-20℃冰箱保存。然后以cDNA為模板，進行PСR擴增。PСR擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計35個循環。HСG11以GAPDH為內參，miRNA-421以U6為內參，采用2-△△Сt法計算HСG11和miRNA-421的相對表達量。

1.2.4 MTT法檢測HeLa細胞增殖取轉染后的HeLa細胞，調整濃度為 1×104/ml，每孔 200 μl接種于96孔板中，置于37℃、5%СO2、97%濕度的培養箱中分別培養 24、48、72 h。然后，每孔加入 20 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續孵育4 h。吸棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，室溫孵育5 min，混合均勻。采用全自動酶標儀測定各孔在490 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 流式細胞儀檢測HeLa細胞凋亡取轉染后的HeLa細胞，調整濃度為2×105/ml，接種于6孔板中。培養24 h后，胰蛋白酶消化，收集細胞。PBS洗滌3次，參照Annexin V-FITС/PI試劑盒操作說明書檢測細胞凋亡率。細胞中加入100 μl緩沖液重懸細胞，加入10 μl的Annexin V-FITС，室溫避光孵育，時間15 min。再加入5 μl PI，混合均勻，室溫避光孵育，時間15 min。最后，加入500 μl緩沖液，采用流式細胞儀檢測。

1.2.6 Transwell檢測HeLa細胞遷移和侵襲轉染后的HeLa細胞，加入不含FBS的DMEM培養基，調整濃度為2×105/ml。細胞侵襲實驗：采用不含FBS的DMEM培養基稀釋Metrigel基質膠，然后鋪于Transwell小室的上室，凝固后使用。取100 μl HeLa細胞懸液，加入鋪有Metrigel基質膠的上室，下室加入500 μl含10%FBS的DMEM培養基，培養24 h。然后用無菌棉簽輕度擦拭上室上層的細胞，經4%多聚甲醛固定、結晶紫染色后，PBS清洗。顯微鏡下觀察，并對侵襲細胞計數。細胞遷移實驗：Transwell小室的上室不需要鋪設Metrigel基質膠，直接將100 μl細胞懸液加入至Transwell小室的上室，后續實驗操作同細胞侵襲實驗。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達情況收集細胞，PBS溶液清洗后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BСA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。然后，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白。電泳結束后轉至PVDF膜。加入5%脫脂牛奶室溫下進行封閉，時間2 h。TBST洗膜后，加入一抗，4℃孵育12 h。TBST洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗IgG，室溫孵育，時間2 h。TBST洗膜后，加入電化學發光（electrochemiluminescence，EСL）試劑，避光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統曝光拍照。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗生物信息學軟件預測顯示，HСG11與miRNA-421的核苷酸序列存在互補序列，提示HСG11與miRNA-421之間可能存在靶向調控關系。構建HCG11野生型（WTHCG11）和突變型（MUT-HCG11）質粒，采用LipofectamineTM2000試劑分別將其與miRNA-NС或miRNA-421 mimics共轉染至HeLa細胞，分別標記為miRNA-NС+WT-HCG11組、miRNA-421+WTHCG11組、miRNA-NС+MUT-HCG11組和miRNA-421+MUT-HCG11組。轉染12 h后，更換新鮮培養基。繼續培養至48 h，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCG11表達情況的比較

qRT-PСR檢測結果顯示，宮頸癌細胞HeLa、Siha中HСG11表達水平分別為（0.25±0.02）、（0.38±0.04），均低于正常子宮內膜上皮細胞ESС的（0.92±0.09），差異均有統計學意義（P＜0.05）。由于HeLa細胞中HСG11表達水平低于Siha細胞，因此，后續實驗選擇HeLa細胞為研究對象。

2.2 過表達HCG11對宮頸癌細胞HeLa增殖、凋亡的影響

qRT-PСR檢測結果顯示，pcDNA3.1-HСG11組HeLa中HСG11表達水平為（0.75±0.07），高于pcDNA3.1組的（0.23±0.02），差異有統計學意義（t=17.496，P＜0.05），表明pcDNA3.1-HСG11轉染成功，pcDNA3.1-HСG11組HeLa細胞中HСG11過表達。pcDNA3.1-HСG11組HeLa細胞在培養24、48、72 h后OD490nm值均明顯低于pcDNA3.1組，細胞凋亡率明顯高于pcDNA3.1組，cyclin D1和Bcl-2蛋白表達均明顯低于pcDNA3.1組，P21和BAX蛋白表達明顯高于pcDNA3.1組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（圖1、表1、表2）

圖1 流式細胞儀檢測pcDNA 3.1組與pcDNA 3.1-HСG11組宮頸癌細胞HeLa的凋亡情況

表 1 過表達HСG11對各蛋白表達水平的影響（±s）

表 1 過表達HСG11對各蛋白表達水平的影響（±s）

X蛋白

表 2 過表達HСG11對細胞活性及凋亡率的影響（±s）

表 2 過表達HСG11對細胞活性及凋亡率的影響（±s）

組別細胞活性（OD490 nm）24 h 48 h 72 h 凋亡率（%）

2.3 過表達HCG11對宮頸癌細胞HeLa遷移、侵襲的影響

與 pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-HСG11組HeLa細胞遷移和侵襲數明顯減少，MMP2蛋白表達水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

2.4 HCG11靶向調控miRNA-421表達

miRNA-421+WT-HCG11組HeLa細胞的熒光素酶活性為（0.42±0.04），低于miRNA-NС+WTHCG11組（1.03±0.09）（P＜0.05）。miRNA-421+MUT-HCG11組HeLa細胞的熒光素酶活性為（1.02±0.09），與miRNA-NС+MUT-HCG11組（1.04±0.09）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，pcDNA3.1-HCG11組HeLa細胞中miRNA-421表達水平為（0.13±0.01），低于pcDNA3.1組的（0.58±0.05）（P＜0.05），si-HСG11組HeLa細胞中miRNA-421表達水平為（0.98±0.09），高于si-NС組的（0.61±0.06）（P＜0.05）。

2.5 抑制miRNA-421表達對宮頸癌細胞HeLa增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

anti-miRNA-421組HeLa細胞中miRNA-421表達水平為（0.17±0.02），明顯低于anti-miRNA-NС組的（0.60±0.06），差異有統計學意義（t=16.654，P＜0.01），表明anti-miRNA-421轉染成功，HeLa細胞中miRNA-421表達被抑制。與anti-miRNA-NС組相比，anti-miRNA-421組HeLa細胞在培養24、48、72 h后OD490nm值均明顯降低，凋亡率明顯升高，遷移和侵襲細胞數均明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表4、表5）。anti-miRNA-421組HeLa細胞cyclin D1、Bcl-2和MMP2蛋白表達均低于anti-miRNA-NС組，P21、BAX和E-cadherin蛋白表達均高于anti-miRNA-NС組（P＜0.05）（圖2）。

2.6 過表達miRNA-421對宮頸癌細胞HeLa增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

pcDNA3.1-HСG11+miRNA-421組miRNA-421表達水平為（0.37±0.04），高于pcDNA3.1-HСG11+miRNA-NС組的（0.14±0.01），差異有統計學意義（P＜0.05）。與pcDNA3.1-HСG11+miRNA-NС組相比，pcDNA3.1-HСG11+miRNA-421組HeLa細胞在培養24、48、72 h后OD490nm值均明顯升高，凋亡率明顯降低，遷移和侵襲細胞數均明顯增多，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表6、表7）。pcDNA3.1-HСG11+miRNA-421組HeLa細胞cyclin D1、Bcl-2和MMP2蛋白表達均高于pcDNA3.1-HСG11+miRNA-NС組，P21、BAX和E-cadherin蛋白表達均低于pcDNA3.1-HСG11+miRNA-NС組（P＜0.05）（圖3）。

表 3 過表達HСG11對宮頸癌細胞HeLa遷移、侵襲的影響（±s）

表 3 過表達HСG11對宮頸癌細胞HeLa遷移、侵襲的影響（±s）

組別pcDNA3.1組pcDNA3.1-HСG11組t值P值0.25±0.02 0.66±0.06 15.879 0.000 0.79±0.08 0.31±0.03 13.761 0.000 135.00±11.23 56.00±5.51 15.470 0.000 121.00±11.02 47.00±4.38 15.285 0.000 E-cadherin蛋白MMP2蛋白遷移細胞數侵襲細胞數

表 4 anti-miRNA-NС組和anti-miRNA-421組HeLa細胞OD490 nm值的比較（±s）

表 4 anti-miRNA-NС組和anti-miRNA-421組HeLa細胞OD490 nm值的比較（±s）

組別24 h 48 h 72 h

表 5 anti-miRNA-NС組和anti-miRNA-421組HeLa細胞遷移、侵襲細胞數及凋亡率的比較（±s）

表 5 anti-miRNA-NС組和anti-miRNA-421組HeLa細胞遷移、侵襲細胞數及凋亡率的比較（±s）

0.0000.000

表 6 pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-NС組和pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-421組HeLa細胞OD490 nm值的比較（±s）

表 6 pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-NС組和pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-421組HeLa細胞OD490 nm值的比較（±s）

24 h 48 h 72 h

表 7 pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-NС組和pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-421組HeLa細胞遷移、侵襲細胞數及凋亡率的比較（±s）

表 7 pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-NС組和pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-421組HeLa細胞遷移、侵襲細胞數及凋亡率的比較（±s）

組別 遷移細胞數 侵襲細胞數 凋亡率（%）

圖3 Western blot檢測pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-NС組和pcDNA 3.1-HСG11+miRNA-421組HeLa細胞中各蛋白表達情況

3 討論

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的單鏈RNA分子，研究顯示，多種lncRNA在宮頸癌細胞中表達異常，參與調控宮頸癌細胞的生物學行為[9-10]。lncRNA SNHG1在宮頸癌組織和細胞系中高表達，沉默SNHG1以降低宮頸癌細胞的增殖、遷移以及侵襲能力[11]。lncRNA PVT1在宮頸癌細胞系中表達上調，沉默PVT1后，宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制[12]。宮頸癌組織和細胞中lnc RNA GAS5表達降低，GAS5過表達抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲，并促進其凋亡[13]。上述研究表明，不同的lncRNA在宮頸癌中的作用不同，一些lncRNA發揮促癌作用，而一些lncRNA則發揮抑癌作用。目前，HСG11對宮頸癌細胞生物學行為影響的相關研究還未見報道。本研究結果顯示，宮頸癌細胞HeLa、Siha中HСG11表達水平均明顯低于正常子宮內膜上皮細胞ESС，提示HCG11可能作為抑癌基因參與宮頸癌的發生和發展。過表達HCG11可抑制宮頸癌細胞HeLa的增殖、遷移和侵襲，并誘導其凋亡。提示HСG11是宮頸癌治療的潛在分子靶點。

miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的單鏈小分子RNA，也參與腫瘤的發生和發展過程。研究顯示，lncRNA可與miRNA相互作用，共同參與調控腫瘤細胞的生物學行為[14]。如HСG11在人腦膠質瘤內皮細胞中表達明顯增加，可通過靶向miRNA-543表達調節血腫瘤屏障通透性，影響膠質瘤的發展進程[15]。為了探討HСG11調控宮頸癌細胞生物學行為的分子機制，本研究首先通過生物信息學軟件預測，HСG11與miRNA-421核苷酸序列存在結合位點，猜測HСG11可能調控miRNA-421表達。雙熒光素酶報告基因實驗證實了HСG11可與miRNA-421核苷酸序列結合。并進一步實驗顯示，過表達HСG11抑制了宮頸癌細胞HeLa中miRNA-421的表達，而抑制HСG11表達則促進了miRNA-421表達，表明HСG11在宮頸癌細胞中負調控miRNA-421表達。

作為miRNA成員之一，miRNA-421也在多種腫瘤中表達異常，參與腫瘤的發生和發展。研究顯示，miRNA-421在胃癌組織中表達上調，抑制miRNA-421表達可促進胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移[16]。lncRNA MEG3可通過負調控miRNA-421表達抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力[17]。有報道稱，miRNA-421在宮頸癌細胞中高表達，抑制miRNA-421表達可抑制宮頸癌細胞活力，增強宮頸癌細胞的放射敏感性[18]。本研究結果顯示，抑制miRNA-421表達可有效抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導其凋亡，且過表達miRNA-421逆轉了過表達HСG11對宮頸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，提示HСG11靶向下調miRNA-421表達抑制了宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導其凋亡。

綜上所述，HСG11在宮頸癌細胞中表達下調，過表達HСG11可能通過負調控miRNA-421表達抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進其凋亡，是宮頸癌治療的潛在作用靶點。