非小細胞肺癌組織中NOTCH 1的表達情況及其與患者臨床特征和EGFR基因突變狀態的關系

莊其宏，陳嵐蘭，盧 芳，黃申暉

廈門大學附屬第一醫院呼吸科，福建 廈門361003

近年來，隨著城市化和工業化的發展，人們生活水平提高的同時，多種疾病的發生率也在不斷上升[1]。據統計，全球每年有100多萬人死于肺癌[2]，肺癌主要包括小細胞肺癌（small cell lung cancer，SСLС）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSСLС），后者包括鱗狀細胞癌、腺癌及大細胞癌。近年來，肺癌的治療取得了長足進步，除傳統治療手段（手術、化療、放療）外，靶向治療的興起也為肺癌的臨床治療提供了一種新的方法。在各種類型的肺癌中，NSСLС最常見，占全部肺癌的80%～90%[3]。隨著分子生物學技術的發展，人們對NSСLС的研究不僅僅停留在藥物治療上，在發病機制上也有了深層次的了解[4]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因過表達或突變均會影響腫瘤細胞的發展。研究表明，EGFR基因是NSСLС靶向治療中最重要的靶點之一，且EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）已成為治療NSСLС的重要藥物之一[5]。然而臨床中發現，EGFR-TKI治療數月后NSСLС患者會出現不同程度的耐藥，因此目前關于其耐藥機制的研究成為熱點[6]。研究發現，notch受 體1（notch receptor 1，NOTСH1）基因 參 與NSСLС的發生和發展，同時NOTCH1基因也與靶向藥物的耐藥性有關[7]。本研究通過免疫組織化學染色法檢測NSСLС組織中NOTСH1的表達情況及其與患者臨床特征和EGFR基因突變狀態的關系，旨在探討EGFR-TKI的耐藥機制，為NSСLС的靶向藥物治療提供新思路，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2017年3月至2018年2月于廈門大學附屬第一醫院接受手術治療的67例NSСLС患者。納入標準[8]：①均經術后病理學檢查證實為NSСLС；②術前未進行中藥治療、生物治療、放療、化療等。排除標準：肺部出現嚴重感染的患者。67例患者中，男43例，女24例；年齡為39～75歲，平均（54.18±12.19）歲；病理類型：鱗狀細胞癌24例，腺癌43例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期19例；分化程度：高/中分化45例，低分化22例；淋巴結轉移41例，無淋巴結轉移26例。所有患者均進行EGFR基因檢測，根據EGFR基因突變狀態的不同將患者分為3組，其中野生組患者29例，突變組（18、19、21外顯子突變）患者20例，耐藥組（20外顯子T790M點突變）患者18例。3組患者的病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結轉移情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

Leica Bond-max全自動免疫組化染色機、RM2235切片機、Bond聚合物精細檢測系統、脫蠟液均購自德國Leica公司，兔抗人NOTСH1多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法

采用免疫組織化學兩步法檢測NSСLС組織中NOTСH1的表達情況，首先對石蠟標本行4 μm連續切片，保證切片完整無空洞、平整無褶皺，無氣泡，常規脫蠟入水。滴加3%H2O2，室溫下孵育10 min，滅活內源性過氧化物酶的活性。熱抗原修復后，室溫下自然冷卻，加入一抗，4℃下放置過夜；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3次，每次2 min，加入NOTСH1抗體，于37℃恒溫箱內孵育20 min；PBS沖洗3次，每次2 min，加入1∶500稀釋的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，稀釋液使用3%脫脂牛奶，于37℃恒溫箱內孵育30 min；再用PBS沖洗3次，每次2 min，然后采用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑進行顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素襯染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知NOTСH1陽性表達的石蠟切片作為陽性對照[9]。

表 1 3組患者的基線特征[ n（%）]

1.4 免疫組織化學染色結果判定

由3名及以上病理醫師采用雙盲法進行閱片。NOTСH1陽性表達定位于細胞膜和（或）細胞質，呈棕黃色或黃色顆粒。200倍顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數200個細胞。陽性細胞所占百分比評分：＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞所占百分比評分與染色強度評分相加，0～1分為陰性，2～3分為陽性[10]。

1.5 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者中NOTCH 1表達情況影響因素的單因素分析

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結轉移的NSСLС患者的NOTСH1陽性表達率均高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為高/中分化、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同病理類型的NSСLС患者的NOTСH1陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表 2 NSСLС患者中NOTСH 1表達情況影響因素的單因素分析（n=67）

2.2 NSCLC患者中NOTCH 1表達情況影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統計學意義的變量納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示，臨床分期、分化程度和淋巴結轉移情況均是NSСLС患者NOTСH1表達情況的獨立影響因素（P＜0.05）。（表3）

表 3 NSСLС患者中NOTСH 1表達情況影響因素的多因素分析（n=67）

2.3 3組患者中NOTCH 1陽性表達率的比較

野生組、突變組、耐藥組患者的NOTСH1陽性表達率分別為51.7%（15/29）、40.0%（8/20）、83.3%（15/18），3組比較，差異有統計學意義（χ2=7.766，P＜0.05）。其中，耐藥組患者的NOTСH1陽性表達率高于野生組和突變組患者，差異均有統計學意義（χ2=4.806、7.446，P＜0.05）。

3 討論

NSСLС是一種常見的惡性腫瘤，隨著近年來環境的不斷惡化，NSСLС的發病率逐年增長[11]。因此，研究NSСLС的治療方法意義重大。目前晚期NSСLС的常用治療方法是以EGFR為靶點的藥物治療，然而患者易產生原發性耐藥及獲得性耐藥，因此，探討EGFR-TKI的耐藥機制已成為醫學研究的熱點[12]。研究發現，NOTСH1與NSСLС靶向藥物的耐藥有關。NOTСH1是NOTСH信號通路中的關鍵受體之一，越來越多的證據表明NOTСH1參與腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡、轉移及化學抗性的調節[13]。Lamb等[14]研究發現，60%～70%的EGFR-TKI獲得性耐藥與EGFR基因20外顯子T790M突變密切相關。相關研究顯示，在EGFRTKI獲得性耐藥的肺癌細胞中，NOTСH1的表達水平上調，更重要的是，NOTСH1促進了上皮-間充質轉化表型的獲得，這與EGFR-TKI的獲得性耐藥密切相關[15]。然而，目前有關不同EGFR突變狀態的NSСLС患者中NOTСH1的表達情況及臨床意義尚未完全明確，本研究通過檢測NSСLС組織中NOTСH1的表達情況，分析NOTСH1表達情況與EGFR基因突變狀態的關系，以期為NSСLС耐藥機制的研究提供新思路。在耐藥組中，EGFR基因20外顯子T790M突變頻率增加，EGFR基因突變可能導致NOTСH信號通路激活，進而導致NOTСH1表達水平上調。

本研究采用免疫組織化學染色法檢測67例NSСLС組織中NOTСH1的表達情況，結果顯示，臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為高/中分化、無淋巴結轉移的NSСLС患者的NOTСH1陽性表達率均低于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同病理類型的NSСLС患者的NOTСH1陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。進一步的Logistic回歸分析結果顯示，臨床分期、分化程度和淋巴結轉移情況均是NSСLС患者中NOTСH1表達情況的獨立影響因素（P＜0.05）。

根據EGFR基因突變狀態的不同，本研究將NSСLС患者分為3組，即野生組、突變組（18、19、21外顯子突變）及耐藥組（20外顯子T790M點突變），并分析不同組別患者的NOTСH1表達情況，結果顯示，耐藥組患者的NOTСH1陽性表達率為83.3%，高于野生組患者的51.7%和突變組患者的40.0%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，臨床分期、分化程度和淋巴結轉移情況均是NSСLС患者中NOTСH1表達情況的獨立影響因素。EGFR-TKI獲得性耐藥的NSСLС中NOTСH1的陽性表達率較高，NOTСH1高表達可能是EGFR-TKI耐藥的重要原因。本研究僅對NOTСH1靶點進行分析，隨著對EGFR-TKI耐藥機制研究的不斷深入，相信越來越多的與EGFR-TKI治療相關的分子標志物及其相互關系也會被發現。