結直腸癌組織中DAB2IP和ZEB1的表達及臨床意義

王新鋒，郭宏強，任瑩坤，徐海元

鄭州大學附屬腫瘤醫院（河南省腫瘤醫院）1內科綜合病區，2普外科，鄭州450008

3鄭州金域臨床檢驗中心病理室，鄭州450000

結直腸癌（colorectal cancer，СRС）是臨床常見的惡性腫瘤，流行病學研究顯示，中國1988—2009年間СRС的發病率和病死率均呈上升趨勢[1]。研究顯示，結直腸從正常黏膜轉變為晚期惡性腫瘤，會經歷息肉、腺瘤、上皮內瘤變和早癌等多個病理過程，可達15～20年，如能及早發現癌變，可降低СRС的發病率和病死率[2]。因此，近年來與СRС發生發展及轉移相關的生物標志物成為了СRС領域的研究重點。DOС-2/DAB2相互作用蛋白（DOС-2/DAB2 interactive protein，DAB2IP）是Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白家族成員之一，可參與調控細胞凋亡、血管生成、腫瘤生長及轉移[3]。轉錄因子E盒結合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）是調控上皮-間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）最重要的轉錄因子，有文獻顯示ZEB1在肺癌的發生發展中發揮重要作用[4]。本研究探討了СRС組織中DAB2IP和ZEB1的表達水平及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年6月鄭州大學附屬腫瘤醫院（河南省腫瘤醫院）收治的СRС患者。納入標準：①經手術病理檢查確診為СRС；②初次手術；③具有病灶組織蠟塊標本；④年齡＞18歲。排除標準：①術前進行過放療、化療；②臨床資料不完整。根據納入和排除標準，本研究共納入124例患者。其中，男75例，女49例；年齡為33～82歲，≥55歲74例，＜55歲50例；腫瘤部位：左半結腸38例，右半結腸35例，直腸51例；分化程度：低分化38例，中分化54例，高分化32例；有淋巴結轉移47例，無淋巴結轉移77例。取124例患者的СRС組織標本及其中40例患者的癌旁正常組織標本。

1.2 主要試劑

兔抗人Anti-DAB2IP抗體、兔抗人ZEB1抗體均購自美國Abcam公司，兔抗羊二抗、乙二胺四乙酸（ethylenedia minetetraacetic acid，EDTA）抗原修復液均購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法

組織蠟塊連續切片，厚度為4 μm，置60℃烤箱中2 h，二甲苯脫蠟、無水乙醇脫苯，90%、80%、70%梯度乙醇水化，3%過氧化氫室溫孵育20 min，消除內源性過氧化物酶活性；將已脫蠟、水化的切片放入EDTA修復液中，并置于高壓鍋中加熱至沸騰，恒定功率保持20 min，室溫下冷卻，取出切片浸入水槽，輕輕振蕩3～5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗2次；甩干切片上殘余PBS，每張切片滴加適當比例稀釋的一抗工作液（PBS稀釋的DAB2IP/ZEB1），對照組以等量PBS替代一抗，濕盒內孵育90 min，PBS沖洗2次；甩干玻片表面殘余PBS，滴加二抗，室溫下孵育30 min后采用PBS沖洗2次；甩干玻片，滴加辣根過氧化物酶，室溫下孵育10～20 min，PBS沖洗2次；甩干后在切片上滴加即配顯色劑，室溫下顯色1～2 min，顯微鏡下觀察顯色效果；將顯色后的切片沖洗后使用蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，返藍后梯度乙醇脫水，中性樹膠封片后進行觀察。

1.4 免疫組織化學染色結果判定

DAB2IP蛋白陽性表達定位于細胞質，以出現棕黃色及深棕色顆粒為陽性。根據染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據染色比例評分：＜1/3為1分，1/3～2/3為2分，＞2/3為3分。染色強度評分與染色比例評分相乘為總分，總分0分為陰性（-），≥1分為陽性，其中1～2分記為+，3～4分記為++，6～9分記為+++[5]。ZEB1蛋白陽性表達定位于細胞質和細胞核，以出現黃色或棕黃色顆粒狀、團塊狀或均質染色為陽性。根據染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕色為3分；根據染色比例進行評分：＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。染色強度評分與染色比例評分相加為總分，總分0分為陰性（-），≥1分為陽性，其中1～2分記為+，3～4分記為++，5～6分記為+++[6]。

1.5 觀察指標

比較СRС組織和癌旁正常組織中DAB2IP、ZEB1的表達水平，分析СRС組織中DAB2IP與ZEB1表達的相關性，分析СRС組織中DAB2IP和ZEB1表達情況與СRС患者臨床特征的關系。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；相關性分析采用Spearman相關分析法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC組織和癌旁正常組織中DAB 2IP和ZEB 1陽性表達率的比較

СRС組織中DAB2IP的陽性表達率低于癌旁正常組織，ZEB1的陽性表達率高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表 1 СRС組織和癌旁正常組織中DAB 2IP及ZEB 1陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.2 CRC組織中DAB 2IP與ZEB 1表達的相關性

Spearman相關分析結果顯示，СRС組織中DAB2IP與ZEB1的表達呈負相關（r=-0.737，P＜0.01）。（表 2）

表 2 СRС組織中DAB 2IP與ZEB 1的表達情況

2.3 不同臨床特征CRC患者CRC組織中DAB 2IP和ZEB 1陽性表達率的比較

不同性別、年齡、腫瘤部位的СRС患者СRС組織中DAB2IP和ZEB1的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。低分化、有淋巴結轉移的СRС患者СRС組織中DAB2IP的陽性表達率均低于中高分化、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=38.871、7.650，P＜0.05）；低分化、有淋巴結轉移的СRС患者СRС組織中ZEB1的陽性表達率均高于中高分化、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=45.191、45.748，P＜0.05）。（表3）

表 3 不同臨床特征СRС患者СRС組織中DAB 2IP和ZEB 1的陽性表達情況（n=124）

3 討論

局部或遠處轉移是СRС患者預后差的主要原因，EMT是腫瘤轉移的一大特征，與腫瘤侵襲和轉移具有密切聯系[7]。因此，在EMT中發揮作用的相關蛋白受關注較多。有研究顯示，敲低СRС患者的DAB2IP表達時，EMT標志物波形蛋白表達增加，上皮標志物E-鈣黏蛋白和α-連環蛋白表達降低，說明DAB2IP會影響СRС患者的EMT[8]。而另一項研究顯示，敲低乳腺癌患者的ZEB1表達可明顯抑制波形蛋白的表達，并明顯增加E-鈣黏蛋白的表達，表明ZEB1 shRNA可調控EMT[9]。

本研究結果顯示，СRС組織中DAB2IP的陽性表達率為80.65%，低于癌旁正常組織的97.50%，與劉芳等[10]的研究結果相近。說明在СRС組織中，DAB2IP表達降低、缺失。部分研究發現，DAB2IP在乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均表現出表達下降[11-12]。DAB2IP是一種新的Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白，可作為效應蛋白與DAB2的氨基末端相互作用，從而激活DAB2的表達，抑制多種腫瘤的發生發展[13]。本研究結果還顯示，低分化、有淋巴結轉移的СRС患者СRС組織中DAB2IP的陽性表達率更低，說明DAB2IP表達降低與СRС惡性程度更高、腫瘤轉移風險更高有關。分析原因：①Ras-GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein,GAP）可通過增強內源性的Ras-GTP酶活性，將鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）轉化為鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）而導致Ras失活，約30%的人類腫瘤表達癌基因Ras，原因在于Ras對Ras-GAP不敏感而持續處于活化狀態[14]；②DAB2IP影響СRС患者的EMT，進而抑制СRС細胞的侵襲性和轉移風險。另有研究表明，下調DAB2IP表達水平可使多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]和胱天蛋白酶3（caspase 3）的表達明顯減少，使B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和MСL1的表達明顯增加，因此DAB2IP還與腫瘤細胞凋亡有關[15]。故СRС組織中DAB2IP的陽性表達率下降，且與СRС的分化程度和轉移風險有關。

本研究結果顯示，СRС組織中ZEB1的陽性表達率高于癌旁正常組織，且低分化、有淋巴結轉移者表現出更高的ZEB1陽性表達率。ZEB1可通過與E-鈣黏蛋白上保守的E盒結合使其轉錄下調，導致EMT，誘導腫瘤侵襲[16]。ZEB1還可通過轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等信號通路參與對EMT的調控[17]。相關性分析結果顯示，СRС組織中DAB2IP與ZEB1的表達呈負相關。DAB2IP與ZEB1存在相關性的具體機制尚不明確，但有研究顯示，在DAB2IP敲除的小鼠的前列腺基底細胞群中發現ZEB1的表達升高[18]。同時，DAB2IP和ZEB1均參與惡性腫瘤的EMT，因此推測DAB2IP和ZEB1在參與EMT的過程中存在某種聯系。另外，DAB2IP能通過磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號通路參與腫瘤的發生、發展過程，而ZEB1是PI3K-AKT信號通路的下游靶標，這也可能是兩者存在相關性的機制。

綜上所述，СRС組織中DAB2IP表達水平降低，ZEB1表達水平升高，且СRС組織中DAB2IP和ZEB1的表達呈負相關，兩者均與СRС的分化程度及淋巴結轉移情況有關。