P-糖蛋白表達(dá)與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系的研究△

陳美元，張 穎，馮建偉，郎金田，崔 剛，張志國(guó)#

北京市大興區(qū)人民醫(yī)院1泌尿外科，2腫瘤內(nèi)科，北京102600

膀胱癌是中國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤之一，其中非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBС）占全部膀胱癌的75%～85%，目前對(duì)NMIBС的治療方案主要為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）聯(lián)合術(shù)后藥物灌注[1]。雖然TURBT術(shù)后膀胱灌注治療能夠降低膀胱癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率，但仍有30%～80%的患者在術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)[2]。藥物的耐藥性被認(rèn)為是膀胱癌復(fù)發(fā)的主要原因，其中P-糖蛋白的過(guò)度表達(dá)被認(rèn)為是引起腫瘤藥物耐藥性增加的主要原因。本研究分析了47例經(jīng)TURBT手術(shù)證實(shí)的NMIBС患者的P-糖蛋白表達(dá)情況及其與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014—2016年于北京市大興區(qū)人民醫(yī)院接受治療的NMIBС患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)為NMIBС；②接受TURBT治療；③術(shù)后單一應(yīng)用吡柔比星規(guī)律腔內(nèi)灌注1年或至治療失敗；④具有至少1年的隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位惡性腫瘤的患者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入47例NMIBС患者，男41例，女6例；年齡為45～92歲，平均（67.10±10.33）歲。隨訪1年，10例患者復(fù)發(fā)，37例患者未復(fù)發(fā)。取初治且隨訪1年未復(fù)發(fā)患者的手術(shù)切除標(biāo)本為A組（n=37），初治且隨訪1年復(fù)發(fā)患者的第1次手術(shù)切除標(biāo)本為B組（n=10），復(fù)發(fā)患者的再次及多次手術(shù)切除標(biāo)本為С組（n=12）。依據(jù)2004年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）膀胱癌組織學(xué)分級(jí)：低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤（papillary urothelial neoplasm of low malignant potential，PUNLMP）1例，低級(jí)別非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌（non-invasive papillary urothelial carcinoma low-grade，NILGС）23例，高級(jí)別非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌（non-invasive papillary urothelial carcinoma high-grade，NIHGС）35例。

1.2 主要試劑

鼠源性抗P-糖蛋白單克隆抗體、鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（strept avidin biotin peroxidase complex，SABС）免疫組織化學(xué)染色試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，小鼠血清購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

采用SABС法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，全部石蠟塊行5 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，采用3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。浸入枸櫞酸鹽緩沖液中微波抗原修復(fù)，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液封閉非特異性蛋白，滴加一抗（小鼠IgG），于4℃過(guò)夜后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后滴加SABС，加入DAB顯色劑，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。另取5例正常膀胱黏膜組織作正常對(duì)照，5例腎癌旁正常腎組織作陽(yáng)性對(duì)照，以正常小鼠血清代替一抗為陰性對(duì)照，以PBS代替一抗為空白對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

P-糖蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，呈棕黃色或棕褐色。每張切片取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)50個(gè)腫瘤細(xì)胞。以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。0分為無(wú)表達(dá)，1～2分為低表達(dá)，3～4分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，等級(jí)資料的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中P-糖蛋白的表達(dá)情況

P-糖蛋白在NMIBС患者的NMIBС組織中出現(xiàn)不同程度的表達(dá)，P-糖蛋白陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜中，呈棕黃色或棕褐色；正常膀胱黏膜組織中未見(jiàn)P-糖蛋白表達(dá)，腎癌旁正常腎組織中高表達(dá)P-糖蛋白。（圖 1）

2.2 不同組別中P-糖蛋白的染色評(píng)分

С組中P-糖蛋白的染色評(píng)分高于（A+B）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.414，P＜0.05）；A組和B組中P-糖蛋白的染色評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 不同組織學(xué)分級(jí)NMIBC組織中P-糖蛋白的表達(dá)情況

P-糖蛋白的表達(dá)情況與NMIBС的組織學(xué)分級(jí)無(wú)相關(guān)性（r=-0.115，P＞0.05）。（表2）

圖1 不同組織中P-糖蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×100）

表 1 不同組別中P-糖蛋白的表達(dá)情況

表 2 不同組織學(xué)分級(jí)NMIBС組織中P-糖蛋白的表達(dá)情況

3 討論

P-糖蛋白是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白，由人多耐藥基因1（multidrug resistance 1，MDR1）編碼，主要定位于細(xì)胞膜上，利用腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水解釋放的能量將一系列結(jié)構(gòu)和功能不同的底物排出細(xì)胞外，P-糖蛋白的這種特性可防止機(jī)體對(duì)有害物質(zhì)的吸收，并介導(dǎo)體內(nèi)物質(zhì)輸出，從而發(fā)揮保護(hù)人體組織器官、維持生理穩(wěn)態(tài)的重要功能，在正常人體的腸、腎、腎上腺、膽管等組織器官中可以檢測(cè)出P-糖蛋白的高表達(dá)[3-4]。P-糖蛋白的這種特性也被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的主要原因，有研究顯示，在包括膀胱癌的多種腫瘤細(xì)胞中可檢出P-糖蛋白的表達(dá)，而在正常的輸尿管及膀胱的尿路上皮細(xì)胞中未檢出P-糖蛋白的表達(dá)[4]。有研究比較了膀胱尿路上皮癌患者化療前后的P-糖蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吡柔比星及表柔比星膀胱內(nèi)灌注化療后患者的P-糖蛋白表達(dá)水平高于化療前[5]，且P-糖蛋白的表達(dá)與膀胱癌的病理分級(jí)密切相關(guān)[6]。這些發(fā)現(xiàn)提示膀胱尿路上皮癌細(xì)胞能誘導(dǎo)P-糖蛋白的表達(dá)，膀胱內(nèi)灌注失敗及膀胱癌復(fù)發(fā)可能與P-糖蛋白的表達(dá)有關(guān)。

膀胱癌是一類生物學(xué)特性多樣且復(fù)發(fā)率較高的腫瘤，如何有效預(yù)測(cè)膀胱癌的復(fù)發(fā)是臨床工作中亟待解決的難題。本研究將P-糖蛋白作為NMIBС復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，以期發(fā)現(xiàn)更加簡(jiǎn)便易行的預(yù)測(cè)方法，但結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)患者初次手術(shù)切除標(biāo)本中P-糖蛋白表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明P-糖蛋白無(wú)法預(yù)測(cè)NMIBС是否復(fù)發(fā)。其可能的原因：①P-糖蛋白誘發(fā)腫瘤多藥耐藥為原發(fā)性耐藥，其在使用抗腫瘤藥物前已經(jīng)存在；②多種環(huán)境刺激可誘導(dǎo)P-糖蛋白的表達(dá)上調(diào)，例如熱休克、活性氧、紫外線照射及細(xì)胞毒藥物[7]，化療藥物只是其中的一種。

本研究結(jié)果顯示，С組中P-糖蛋白的染色評(píng)分高于（A+B）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），該結(jié)果與國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果一致[8-10]，說(shuō)明吡柔比星能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞中P-糖蛋白的表達(dá)，此亦可看作腫瘤細(xì)胞自我防御的表現(xiàn)。由于P-糖蛋白的表達(dá)調(diào)控與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路有關(guān)，因此以P-糖蛋白為靶點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的策略仍是目前研究的熱點(diǎn)之一[11]。本研究同時(shí)對(duì)P-糖蛋白的表達(dá)與NMIBС組織學(xué)分級(jí)的相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示兩者之間不存在相關(guān)性，該結(jié)果與國(guó)內(nèi)外的部分研究結(jié)果一致[10,12]。但也有研究報(bào)道膀胱癌患者的P-糖蛋白表達(dá)與其組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)[6]，與本研究結(jié)果不一致的原因：①采用的組織學(xué)分級(jí)方法不同；②NMIBС具有較大的異質(zhì)性。

綜上所述，P-糖蛋白尚不能作為T(mén)URBT術(shù)后NMIBС是否復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，且P-糖蛋白表達(dá)與NMIBС的組織學(xué)分級(jí)無(wú)相關(guān)性，但術(shù)后吡柔比星化療藥物灌注可導(dǎo)致復(fù)發(fā)后的腫瘤細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤對(duì)藥物的耐藥性增加，這將為T(mén)URBT術(shù)后NMIBС復(fù)發(fā)的治療提供指導(dǎo)，從而有利于為患者制訂更加個(gè)體化的治療方案。