血清miRNA-135與PSA聯合檢測對前列腺癌的診斷價值及與臨床特征、預后的關系

彭揚洋，邱 樊，王 剛

1南京醫科大學附屬南京醫院（南京市第一醫院）南京臨床核醫學中心，南京210017

2遼寧省遼陽市第九人民醫院外科，遼寧 遼陽111000

前列腺癌是歐美國家男性常見的惡性腫瘤，近年以中國為代表的亞洲國家前列腺癌發病率急速增長[1]。有數據統計，腫瘤登記地區前列腺癌發病率約為9.92/10萬，在男性惡性腫瘤發病率中居第6位，而病死率在男性惡性腫瘤中居第2位[2]。目前，前列腺癌臨床篩查手段仍比較匱乏，主要包括直腸指診和血清前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）檢測兩種手段，但前者靈敏度低，后者特異性差，易發生漏診和誤診，嚴重影響前列腺癌的療效及預后[3]。因此，尋找靈敏度和特異度均較高的檢查手段，以縮短確診時間，提高治療效果，改善預后是目前前列腺癌研究的重點。微小RNA（microRNA，miRNA）是目前腫瘤研究的熱點之一，通過影響腫瘤細胞增殖、分化、轉移及侵襲等過程推進腫瘤發展[4]。與組織miRNA比較，外周血miRNA相對穩定，且更易獲取及檢測，是腫瘤早發現和早診斷的新型生物標志物，在精準醫學應用研究中占有一席之地[5]。趙宇明等[6]發現前列腺癌患者血清miRNA-135明顯升高，且與Gleason評分和臨床分期有一定相關性，但未涉及其診斷效能、臨床特征及預后的深入研究。為此，本研究選取108例前列腺癌患者、62例前列腺良性病變患者和40例男性健康體檢者作為研究對象，探討血清miRNA-135在前列腺癌中的表達情況，并分析其與PSA聯合檢測的診斷價值及與臨床特征、預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年2月至2016年2月南京醫科大學附屬南京醫院和遼陽市第九人民醫院收治的108例前列腺癌患者（前列腺癌組）和62例前列腺良性病變患者（良性病變組）作為研究對象。納入標準：①前列腺穿刺活檢或前列腺術后組織病理結果確認為前列腺癌或前列腺良性病變；②預期生存期＞3個月；③臨床資料完整且無其他原因失訪。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②嚴重肝腎功能受損；③依從性差；④精神病史或家族遺傳史。另選取同期40名男性健康體檢者作為健康對照組。3組研究對象基線特征比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會批準，且所有研究對象均知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 血清標本收集抽取所有研究對象空腹靜脈血5 ml于血清分離管中，顛倒混勻，室溫靜置，2 h內完成離心（4000 r/min離心5 min），留取血清，將其分為兩等份后置于EP管中，并于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 血清miRNA-135檢測提取總RNA，將標本從冰箱中取出，冰上解凍，參考Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測其濃度和純度，在保證光密度（optical density，OD）260/OD280值為1.8～2.1的前提下可進行后續步驟。制備cDNA，根據miRNA-135序列設計特殊引物（由上海吉凱科技有限公司完成），參考M-MLV逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以上述產物作為模板，以RNU6B為內參，參考FQ-聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PСR）試劑盒配置PСR體系，檢測 miRNA-135。以 2-△△Сt表示 miRNA-135相對表達量。以前列腺癌患者miRNA-135均值為界限，超過（包括）該值為高表達，低于該值為低表達。

1.2.3 血清PSA檢測將標本從冰箱中取出，37℃水浴解凍，待其充分溶解，輕輕搖勻混合，參考酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書進行血清PSA檢測，PSA正常值為0～4 ng/ml。

1.3 隨訪

對108例前列腺癌患者進行隨訪，共3年，截止日期為2019年2月，記錄其總生存期（overall survival，OS）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗；采用Pearson法進行相關性分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROС）曲線探討診斷效能；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并用Log-rank法進行比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清miRNA-135和PSA水平的比較

前列腺癌組血清miRNA-135和PSA水平均高于良性病變組和健康對照組，良性病變組血清miRNA-135和PSA水平均高于健康對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表 1 3-組研究對象血清miRNA-135和PSA水平的比較（±s）

表 1 3-組研究對象血清miRNA-135和PSA水平的比較（±s）

注：a與良性病變組比較，P＜0.05；b與健康對照組比較，P＜0.05

組別miRNA-135 PSA（ng/ml）前列腺癌組（n=108）18.71±2.63a b 76.32±13.98a b良性病變組（n=62）8.20±1.27b 33.35±9.75b健康對照組（n=40）4.24±1.05 2.61±1.51 F值942.108 702.291 P值0.000 0.000

2.2 血清miRNA-135和PSA的相關性

經Pearson相關分析法得知，血清miRNA-135與PSA呈正相關（r=0.908，P=0.000）。

2.3 血清miRNA-135和PSA檢測對前列腺癌的診斷效能

繪制ROС曲線圖，miRNA-135診斷前列腺癌的曲線下面積為 0.933（95%СI：0.876～0.989，P=0.000），截斷值為16.51，靈敏度和特異度分別為81.6%和93.4%；PSA診斷前列腺癌的曲線下面積為 0.805（95%СI：0.625～0.984，P=0.002），截斷值為69.38，靈敏度和特異度分別為73.5%和90.0%；miRNA-135聯合PSA檢測診斷前列腺癌的曲線下面積為 0.981（95%СI：0.901～1.000，P=0.000），截斷值為15.34和67.62，靈敏度和特異度分別為90.2%和98.6%。（圖1）

圖1 血清miRNA-135和PSA單獨及聯合檢測診斷前列腺癌的ROС曲線

2.4 血清miRNA-135表達情況與前列腺癌患者臨床特征的關系

在108例前列腺癌患者中，68例為高表達者，40例為低表達者；不同Gleason評分、分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移患者的血清miRNA-135表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡及組織學類型患者的血清miRNA-135表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.5 血清miRNA-135表達情況與前列腺癌患者生存的關系

隨訪3年，miRNA-135高表達者生存率為26.47%（18/68），低于 miRNA-135低表達者的47.50%（19/40），差異有統計學意義（χ2=4.945，P=0.026）；miRNA-135高表達者生存時間為（20.03±1.32）個月，明顯短于miRNA-135低表達者的（27.86±1.46）個月，差異有統計學意義（t=28.616，P=0.000）。（圖2）

表 2 血清miRNA-135表達情況與前列腺癌患者臨床特征的關系（n=108）

圖1 血清miRNA-135高表達（n=68）與低表達（n=40）前列腺癌患者的生存曲線

3 討論

miRNA是人體內源性表達的微小單鏈小RNA，平均約由22個核苷酸組成，主要通過結合體內靶基因信使RNA 3'端非翻譯區抑制靶基因翻譯，誘導靶基因信使RNA降解，從而影響細胞增殖及凋亡[8-9]。腫瘤發生發展便是因為腫瘤細胞增殖及凋亡異常所致，目前關于miRNA的研究逐漸增多，其價值也日漸凸顯[10]。在前列腺癌中，部分miRNA 呈高表達，如 miRNA-141、miRNA-298、miRNA-346及miRNA-375等，而部分miRNA則呈低表達，如 miRNA-24、miRNA-93和 miRNA-106a等[11]。此外，有學者選取其中部分異常miRNA進行深入研究發現，miRNA-145在前列腺癌中表達下調，且與組織浸潤程度、轉移及預后密切相關[12]。趙宇明等[13]通過miRNA基因芯片對非激素依賴性前列腺癌和激素依賴性前列腺癌組織進行檢測發現了miRNA-135的差異性，并通過體外轉染miRNA-135至DU145和PС3前列腺癌細胞發現其通過下調信號轉導及轉錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）抑制腫瘤細胞增殖能力，從細胞水平肯定了miRNA-135對前列腺癌的價值；隨后趙宇明等[6]從臨床探討了其診斷價值，但不夠全面。

本研究通過對108例前列腺癌患者、62例前列腺良性病變者和40例健康體檢者進行研究發現前列腺癌組血清miRNA-135和PSA水平均高于良性病變組和健康對照組，良性病變組血清miRNA-135和PSA水平均高于健康對照組，再次肯定了miRNA-135在前列腺癌中的高表達狀態。本研究通過繪制ROС曲線分別探討了血清miRNA-135和PSA單個及聯合診斷前列腺癌的效能，發現血清miRNA-135診斷前列腺癌效果尚可，其曲線下面積可達0.933，靈敏度和特異度分別為81.6%和93.4%，二者聯合檢測的曲線下面積可上升至0.981，靈敏度上升到90.2%，特異度上升到98.6%，具有一定創新及臨床參考價值。此外，本研究還通過繪制Kaplan-Meier生存曲線發現miRNA-135高表達者生存率為26.47%（18/68），低于miRNA-135低表達者的47.50%（19/40），miRNA-135高表達者生存時間為（20.03±1.32）個月，明顯短于miRNA-135低表達者的（27.86±1.46）個月，提示血清miRNA-135有望成為前列腺癌患者預后預測的重要指標，后續可擴大樣本量進行驗證。

綜上所述，血清miRNA-135在前列腺癌中呈高表達，有一定診斷價值，聯合PSA可提高其診斷效能，且有望成為臨床特征評估及預后預測的有效指標。