肌腱蛋白C在宮頸癌中的表達及與臨床特征及預后的關系

劉菊英，閻 臻，聶文靜

鄭州市婦幼保健院門診辦，鄭州450012

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，主要分為原位癌和浸潤癌，前者多發于30～35歲，后者多發于45～55歲；有數據顯示，其發病年齡有年輕化傾向[1]。近年，隨著篩查手段不斷完善及普及，宮頸癌的治療效果及預后均有明顯改善，但尋找有效敏感的特異性標志物仍是宮頸癌研究的重點之一[2]。肌腱蛋白С（tenascin С，TNС）是目前新發現存在于細胞外基質中的一種具有獨特六臂體結構的糖蛋白，與各類肌肉組織及器官的組建密切相關，尤其在胚胎期心臟發育中扮演重要角色[3-4]。此外，TNС又稱為細胞黏合素С，通過介導腫瘤細胞增殖、遷移、逃逸及新生血管生成等參與腫瘤發生發展，在乳腺癌、子宮內膜癌及卵巢癌等女性相關腫瘤中均有表達[5-7]，但關于其與宮頸癌的相關報道較為少見，值得探討。為此，本研究選取104例宮頸癌患者作為研究對象，探討TNС在宮頸癌中的表達及其與臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年2月至2015年4月于鄭州市婦幼保健院診治的104例宮頸癌患者作為研究對象，收集患者的宮頸癌組織及癌旁正常組織（距腫瘤病灶2 cm）。納入標準：①符合《國際婦產科聯盟2012版宮頸癌診治指南》[8]中宮頸癌的診斷標準；②首次診治，且入組前未接受任何治療；③2009版FIGO分期標準[9]評價臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期，且均行子宮切除術，預計生存期＞3個月。排除標準：①合并其他原發性惡性腫瘤；②近半年內參加過相關研究；③期間因其他原因死亡。104例宮頸癌患者中，年齡26～60歲，平均（37.68±5.12）歲；臨床分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期38例，Ⅲ期21例；病理類型：鱗狀細胞癌62例，腺癌28例，腺鱗癌14例；分化程度：低分化35例，中高分化69例；肌層浸潤：＜1/2 59例，≥1/2 45例；有淋巴脈管間隙浸潤48例，無淋巴脈管間隙浸潤56例。本研究經過醫院倫理委員會批準，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 取材與保存將宮頸癌組織及癌旁正常組織經簡單清洗后（除去組織表面血液和其他脂肪組織等）置于RNA保存液中，于-80℃液氮中長期保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測宮頸癌組織和癌旁正常組織中TNC mRNA表達情況取出組織后參考Trizol試劑盒（購自美國Invitrogen公司）提取總RNA，后采用紫光分度儀（購自美國MilliPore公司）檢測其A260/A280值。參考逆轉錄M-MLV試劑盒（購自加拿大Fermentas公司），將A260/A280值在1.8～2.0的RNA進行反轉錄獲得cDNA，其中TNC上游引物為5'-GAGATGССAAGAСTСGСTAСA-3'，下 游 引 物 為5'-GTTGAСAСGGTGAСAGTTССT-3'；參照基因為 GAPDH，上游引物為5'-GССAAAAGGGTСATСATСTС-3'，下游引物為5'-GTAGAGGСAGGGATGATGTTС-3'。參考qRT-PСR試劑盒（購自美國Invitrogen公司）完成PСR反應體系的配置，反應體積為15 μl，后將其放入СFX96 qRT-PСR儀，按95℃ 10 min、95℃30 s、60℃1 min，共40個循環進行操作。以2-△△Сt法表示TNC mRNA的相對表達量。

1.2.3 免疫組化法檢測宮頸癌組織和癌旁正常組織中TNC蛋白表達情況常規石蠟切片，60℃烤片3～4 h；常規脫蠟后進行內源性過氧化酶阻斷，后采用檸檬酸修復液高壓鍋法完成修復；滴加兔抗人TNС單克隆抗體（一抗，1∶100稀釋，購自英國Abcam公司）；添加二抗（通用型鼠抗兔單克隆抗體，購自英國Abcam公司）；添加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）酶底物顯色劑（購自丹麥Dako公司）后顯微鏡觀察，控制顯色反應，1 min后純水清洗；將玻片置于蘇木素染色液中進行復染1 min，后經流水、梯度乙醇（95%-85%-75%）、二甲苯和中性樹膠完成操作。

1.3 結果判定

TNС蛋白主要表達于細胞外基質處，為棕色或黃色顆粒，主要分為4個等級：“-”，未見任何棕色或黃色顆粒；“+”，呈局部性分布，未形成明顯的條索狀特異性染色；“++”，明顯表達，形成明顯的條索狀及網格狀特異性染色；“+++”，大量表達，形成明顯的條索狀及網格狀特異性染色。采用雙盲法由兩個高年資病理科醫師在400倍光學顯微鏡下進行觀察，對于意見不統一的切片予以剔除。

1.4 隨訪

出院后，對所有患者進行隨訪，共3年，第1年每3個月隨訪1次，第2年每6個月隨訪1次，第3年僅隨訪1次，隨訪方式以門診和住院復診為主，完成肺、肝、腎和腦等器官的影像學檢查，警惕復發及轉移；期間若有不適，立即入院復查。記錄患者無病生存期和總生存期，無病生存期指從入組開始至疾病復發或由于疾病進展（腫瘤增長或腫瘤原發病灶轉移或發現新的病灶等）導致患者死亡的時間，總生存期指從入組開始至因任何原因（排除非腫瘤因素）導致患者死亡的時間。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較生存率；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織和癌旁正常組織中TNC mRNA相對表達量的比較

宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量為（3.64±0.68），明顯高于癌旁正常組織的（1.18±0.23），差異有統計學意義（t=34.948，P=0.000）。

2.2 宮頸癌組織和癌旁正常組織中TNC蛋白表達情況的比較

所有組織均獲得一致結果，無剔除。宮頸癌組織中TNС蛋白陽性表達率為78.85%（82/104），明顯高于癌旁正常組織的32.69%（34/104），差異有統計學意義（χ2=44.906，P＜0.01）。（表1）

2.3 不同臨床特征的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNC mRNA及TNC蛋白表達情況的比較

臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期、低分化、有淋巴脈管間隙浸潤的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量均明顯高于臨床分期為Ⅰ期、中高分化、無淋巴脈管間隙浸潤的患者，差異均有統計學意義（t=4.778、6.391、5.464，P＜0.01）；臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期、低分化、有淋巴脈管間隙浸潤的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNС陽性表達率均高于臨床分期為Ⅰ期、中高分化、無淋巴脈管間隙浸潤的患者，差異均有統計學意義（χ2=7.055、5.007、6.162，P＜0.05）；不同年齡、病理類型及肌層浸潤情況的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量及TNС陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表 2 不同臨床特征的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNCmRNA及TNС蛋白表達情況（n=104）

2.4 生存情況分析

經3年隨訪，TNС陽性表達宮頸癌患者的生存率為35.37%（29/82），無病生存率為31.71%（26/82），均低于TNС陰性表達患者的68.18%（15/22）和59.09%（13/22），差異均有統計學意義（χ2=7.653、5.550，P＜0.05）。（圖1、圖2）

3 討論

圖1 TNС陽性表達（n=82）與陰性表達（n=22）宮頸癌患者的無病生存曲線

圖2 TNС陽性表達（n=82）與陰性表達（n=22）宮頸癌患者的生存曲線

腫瘤微環境是指包括腫瘤細胞及附近基質細胞在內的一組異質性細胞群體，在腫瘤的增殖、侵襲及轉移中有重要作用，尤以后者作用突出，其通過相關產物介導腫瘤的發生發展。TNС是腫瘤微環境中重要的細胞外基質相關蛋白，已在多種腫瘤中被發現[10-11]。有研究顯示，TNC基因在正常人群中表達較少，但在胎兒、組織感染、創傷及腫瘤中呈高表達[12]。Jachetti等[13]在前列腺癌的研究中發現TNC基因可抑制機體免疫系統，幫助腫瘤細胞逃逸。

本研究發現，宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，提示TNС在宮頸癌中呈高表達。后經探討其編碼mRNA和蛋白與宮頸癌臨床特征的關系中發現，臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期、低分化、有淋巴脈管間隙浸潤的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量及TNС陽性表達率均高于臨床分期為Ⅰ期、中高分化、無淋巴脈管間隙浸潤的患者，這與其他研究者[14-15]在TNC基因與子宮內膜癌關系的研究結果基本一致，提示臨床工作者可通過檢測腫瘤組織中TNС表達情況輔助完成患者臨床特征的判斷。此外，本研究通過采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線發現，TNС陽性表達患者生存率和無病生存率均明顯低于TNС陰性表達患者，提示其有望成為宮頸癌靶向治療及預測預后的一個重要指標。

綜上所述，TNС在宮頸癌中高表達，與臨床分期、分化程度及淋巴脈管間隙浸潤情況有關，有望成為預測其預后的有效指標。