卵巢癌細胞多藥耐藥中miR-193a-3p 的表達及作用

孫正偉，馬蓉，徐福霞，徐漢杰，趙衛東

[1.安徽省第二人民醫院婦產科，合肥 230041；2.安徽省婦幼保健院婦產科；3.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)婦產科]

婦科癌癥中死亡的主要原因之一是卵巢癌。大多數病例是隱匿發病，且沒有準確有效的早期診斷方法。確診后，70% 至80% 的患者已為晚期。目前，臨床上治療卵巢癌的標準方法是腫瘤細胞減滅術和基于鉑類和紫杉醇的術后聯合化療。但是，由于腫瘤細胞存在多重耐藥性，卵巢癌5 年生存率僅僅只達30%[1]。多藥耐藥性已成為有效治療卵巢癌的主要障礙。為了改善卵巢癌的預后，對多藥耐藥機制的研究已成為關鍵。近年來，涉及調節腫瘤細胞對化學療法耐受性的微小RNA(microRNAs)的研究成為熱門話題。對于卵巢癌，如miR-20a[2]，miR-137[3]，miR-205[4]和miR-519a[5]等已報道與化療耐藥有關。最近的研究[6]表明miR-193a-3p 參與CD44+胃癌細胞中順鉑耐受性的調節。還未見關于miR-193a-3p 是否參與卵巢癌多藥耐藥性機制的研究報道。這項研究通過MTT 分析篩選出多藥敏感卵巢癌細胞系及多藥耐藥卵巢癌細胞系。qRT-PCR檢測miR-193a-3p 在上述兩種卵巢癌細胞系中的表達，探討miR-193a-3p 與卵巢癌細胞多藥耐藥的關系及其作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人卵巢癌細胞系HO8910，ES-2 和SKOV-3 來源于中國科學院上海細胞研究所；A2780細胞系來自北京協和醫院腫瘤細胞庫。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS，美國Invitrogen公司生產)，McCoy's 5A，RPMI Medium-1640，DMEM(美國Gibco 公司生產)；MTT(美國Sigma 公司生產)；紫杉醇(Pa，哈爾濱藥業集團生產)，順鉑(Ci，江蘇豪森制藥有限公司生產)，卡鉑(Kp，齊魯制藥有限公司生產)，多西紫杉醇(Dt，江蘇恒瑞制藥有限公司生產)和依托泊苷(It，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產)；miR-193a-3p mimic，miR-193a-3p 引物，the scramlble sequence(NC，negative control)和轉染試劑ribo FECTTMCP 轉染試劑盒購于廣州瑞博生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用包含10%FBS 的McCoy's 5A培養基培養人卵巢癌細胞系SKOV-3 和ES-2，使用包含10%FBS 的DMEM 培養基培養細胞系HO8910，并用RPMI Medium-1640 培養細胞系A2780，均培養在5%二氧化碳(CO2)，37 °C 的培養箱中。

1.2.2 MTT 法檢測四種卵巢癌細胞對五種化療藥的IC50值 對數生長期的卵巢癌細胞系經胰酶消化并接種在96 孔板中。經24 h 細胞貼壁，將五種化療藥(順鉑，紫杉醇，多西紫杉醇，卡鉑和依托泊苷)添加到五種梯度濃度中的每一種中。經72 h 孵育后，向每個孔中添加20 μL(5 mg/mL)MTT 試劑，并繼續在孵育箱中孵育4 h。除去培養基，向每個孔中加入150 μL DMSO 以溶解甲瓚，然后輕輕搖動振蕩器10 min 以完全溶解甲瓚。酶標儀使用波長570 nm 來測量吸光度(OD)值。通過Msvbvm50 軟件計算與每種細胞的50%抑制率相對應的藥物及濃度。重復實驗3 遍。

1.2.3 定量實時PCR(qRT-PCR)法檢測miR-193a-3p表達 用Trizol 法從卵巢癌細胞中提取5 μg 的總RNA 與10 nm dNTPS 1 μL 和100 nm Oligo-dT 1 μL混合。在65℃下加熱5 min 后，立即將其置于冰上2 分鐘。加入反轉錄混合物(5 X RT 緩沖液4 μL，0.1 mm DTT 2 μL，Rnase 抑制劑，反轉錄酶50 u)，在42 °C 反應50 min 以合成cDNA。通過在70 ℃下加熱10 min 來終止反應，并在-20 ℃下保存。使用SYBR Green 方法在定量實時 PCR 儀器(FTC-3000P，加拿大豐凌生物技術有限公司)中檢測miR-193a-3p 的表達水平。

1.2.4 miR-193a-3p mimic 的瞬時轉染 在轉染前，將卵巢癌細胞接種并在6 孔板中培養，以達到30%至50%的細胞密度。對每個孔的轉染樣品制備：用120 μL 1 X Ribo FECTTMCPBuffer 稀釋20 μM miR-193a-3pNC/ mimic 5 μL。輕輕搖勻，加入Ribo FECTTMCP 試劑12 μL，吹打輕輕混勻，然后在室溫下孵育15 min。將上述混合液體添加到1863 μL 細胞培養基中并輕輕混合。將培養板放置在37 °C 的CO2培養箱中24 h，用于從細胞中提取總RNA 并接種96 孔板，用于化療藥物對卵巢癌細胞的MTT 實驗。重復實驗3 遍。

1.3 統計學處理 使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計，α=0.01 為檢驗水準。ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)和SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細胞系)之間的miR-193a-3p 表達差異及在ES-2 細胞中轉染NC 和miR-193a-3p mimic 后的miR-193a-3p 表達差異以及ES-2 細胞對四種化療藥(紫杉醇，卡鉑，多西紫杉醇和依托泊苷)中每種藥物耐受性的變化差異，均應用t 檢驗。

2 結果

2.1 MTT 法檢測五種化療藥對細胞系HO8910，ES-2，A2780，SKOV-3 的IC50值 用MTT 法測定五種化療藥(紫杉醇、卡鉑、順鉑、多西紫杉醇和依托泊苷) 對四種卵巢癌細胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)的IC50值。在排除順鉑后，從剩余的四種化療藥中篩選出ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)和SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細胞系)。兩種卵巢癌細胞系的具體值見表1。

表1 五種化療藥對ES-2 及SKOV-3 的IC50值

2.2 miR-193a-3p 在ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)及SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細胞系)中的表達 結果表明，其在卵巢癌細胞系ES-2中低表達，而在卵巢癌細胞系SKOV-3 中高表達，差異有統計學意義(t=9.41，P ＜0.01)。如圖1所示。

圖1 qRT-PCR 方法檢測miR-193a-3p 在ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)及SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細胞系)中的表達

2.3 miR-193a-3p mimic 可提高ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)對三種化療藥的耐藥性 與NC 組 相 比，轉 染 了 miR-193a-3p mimic 組 中miR-193a-3p表達顯著升高(t=57.73，P ＜0.01)，如圖2 所示。在轉染NC 和miR-193a-3p mimic 后，通過MTT 方法檢測ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)對四種化療藥(紫杉醇、卡鉑、多西紫杉醇及依托泊苷)的敏感性。結果表明，與NC 組相比，轉染了miR-193a-3p mimic 組中，ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)對三種化療藥(紫杉醇、卡鉑、多西紫杉醇)的耐藥性顯著提高(除依托泊苷外)，差異有統計學意義(t=6. 05，P ＜0.01；t=4.23，P ＜0.01；t=9.19，P ＜0.01)，如圖3 所示。

圖2 qRT-PCR 方法檢測ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)轉染NC 及miR-193a-3p mimic 后miR-193a-3p 的表達

圖3 MTT 方法檢測在ES-2 (相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)中轉染NC 和miR-193a-3p mimic 后對四種化療藥的敏感性

3 討論

目前，有效治療卵巢癌的主要障礙為化療耐藥，特別是多藥耐藥[7-8]。近年來，對卵巢癌化療耐藥機制的研究成為一個熱門話題[9]。例如，MicroRNAs(miRNAs)是一組非編碼的小RNA，它們在轉錄后水平上調節蛋白質編碼基因的表達，并參與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移和代謝以及多藥耐藥等[10]。而有關miR-193a-3p 的研究團隊表明，miR-193a-3p可以通過在體內外抑制SRSF2，PLAU，LOXL4，HIC2，HOXC9，ING5 和PSEN1 的表達來調節NF-kB，DNA 損傷，Oxidative stress，Notch 和Myc/max 五個信號通路，提高了膀胱癌對多種化療藥的耐藥性[11-12]，并初步證實miR-193a-3p 的表達同4種化療藥(吡柔比星，阿霉素，羥基喜樹堿和鹽酸表柔比星)的耐藥性密切相關，而最近有研究[6]報道，miR-193a-3p 參與CD44+胃癌細胞對順鉑的耐藥機制調節。目前為止，有關miR-193a-3p 在卵巢癌化療耐藥中的機制研究較少。

在這項研究選擇了四種卵巢癌細胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)作為研究對象，并依據最新的NCCN 指南從第一線化療藥中選擇了順鉑、卡鉑和紫杉醇。并從第二線化療藥中選擇了依托泊苷和多西紫杉醇。用MTT 法測定5 種化療藥(紫杉醇、卡鉑、順鉑、多西紫杉醇和依托泊苷)對4種卵巢癌細胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)的IC50值。在排除順鉑后，從剩余的四種化療藥中篩選出ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)和SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細胞系)。用qRT-PCR 檢測miR-193a-3p 在ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)及SKOV-3(相對多藥最耐藥的卵巢癌細胞系)中的表達。結果表明，miR-193a-3p在卵巢癌細胞系ES-2 中低表達，而在卵巢癌細胞系SKOV-3 中高表達。于是，將NC 和miR-193a-3p mimic 轉染到ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)中，并使用qRT-PCR 檢測轉染效率，與NC 組相對比，轉染了miR-193a-3p mimic 組中miR-193a-3p表達相對增加約3 258 倍。進而，在轉染NC 和miR-193a-3p mimic 后，通過MTT 方法檢測ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)對4 種化療藥(紫杉醇，卡鉑，多西紫杉醇及依托泊苷)的敏感性，與NC 組相對比，轉染了miR-193a-3p mimic 組中，ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)對3 種化療藥(紫杉醇，卡鉑，多西紫杉醇)的耐藥性顯著提高(除依托泊苷外)。這與關于胃癌[6]、肝細胞肝癌[13]和膀胱癌[11-12]的文獻中的報道結果相似。未來的研究重點在于：進一步探究miR-193a-3p 是通過作用哪些下游的蛋白編碼基因來參與卵巢癌的多藥耐藥機制的調節。

綜上所述，miR-193a-3p mimic 可以增加ES-2(相對多藥最敏感的卵巢癌細胞系)對卡鉑，紫杉醇和多西紫杉醇的耐藥性。這可能為判斷卵巢癌患者的預后提供新的分子標志物，并選擇敏感的化療藥，可能為將來對卵巢癌的多藥耐藥性或基因靶向治療的基礎或臨床研究提供新思路。