二氫楊梅素對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用研究

王署美 王 琳 王 碩 李萬忠 李海健 呂艷娜 趙春貞

二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)是一種存在于天然植物中的多酚羥基雙氫黃酮類化合物，廣泛存在于葡萄科屬植物，其藥理作用廣泛。研究發現，二氫楊梅素具有調節血脂、保護神經系統、保護心血管、抗炎等多種藥理作用，可改善阿爾茨海默病大鼠的認知功能[1～4]。目前二氫楊梅素對于H2O2誘導的PC12細胞損傷的作用尚未見報道。本研究利用H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷模型，探討二氫楊梅素的作用效果及機制。

材料與方法

1.細胞及培養:大鼠高分化嗜鉻瘤細胞PC12細胞株購自中國科學院上海細胞庫，細胞采用高糖DMEM培養液，加10%的胎牛血清，于37℃、5% CO2條件下常規培養。

2.主要試劑：二氫楊梅素(DHM，HPLC≥98%)購自美國Sigma-Aldrich公司；高糖DMEM培養液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍購自美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Hoechst 33342購自美國Sigma-Aldrich公司；Bax、Bcl-2和caspase-3兔多克隆抗體，GAPDH小鼠多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，抗兔IRdye700及抗鼠IRdye800熒光標記的二抗購自美國LI-COR公司。

3.細胞分組及干預:細胞隨機分組，分為正常對照組、模型組(100μmol/L H2O2)、DHM低劑量組(10μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)、DHM低劑量組(20μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)、DHM低劑量組(40μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)。PC12細胞采用DHM干預0.5h后，給予H2O2進行處理，24h后進行相關指標檢測。

4.細胞活性檢測:取對數生長期的PC12細胞，以5×105個/毫升接種于96孔培養板，每孔加入100μl細胞懸液，二氧化碳孵箱中培養24h后，加入終濃度10、20、40μmol/L的DHM溶液作用0.5h后，加100μmol/L的H2O2溶液繼續培養24h。避光加入終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4h后，加入100μl的DMSO，震蕩10min使結晶充分溶解，于酶標儀檢測570nm波長處的A值，計算細胞存活率，實驗平行重復3次。細胞活性(%)=實驗組平均值/對照組平均值×100%。

5.LDH檢測:采用ELISA法測定細胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)含量。取對數生長期的PC12細胞，按5×104個/孔接種于24孔細胞培養板中培養過夜。細胞隨機分組，培養24h后收集上清液按照乳酸脫氫酶試劑盒說明書操作說明測定LDH含量。LDH(%)=實驗組平均值/對照組平均值×100%。

6.Hoechst 33342染色:取對數生長期的PC12細胞接種于24孔板，至于CO2孵箱37℃培養24h，等細胞貼壁后，將細胞隨機分組，加終濃度為10、20、40μmol/L的DHM處理后0.5h，加100μmol/L的H2O2溶液處理，置于CO2孵箱繼續培養24h，棄去培養液，用PBS洗滌2遍，每次5min，加冰甲醇固定10min，棄去固定液，用PBS清洗3遍，每次5min，加入10μg/ml的Hoechst 33342染色液，室溫避光染色10min，棄掉染色液，用PBS清洗2遍，每次5min，吸棄液體，用碳酸甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞的形態變化。顯微鏡下選取5個視野，計數凋亡細胞百分比取平均值。

7.Western blot法檢測：細胞處理同上，24h后收集細胞，加適量細胞裂解液，冰上裂解30min，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，與加樣緩沖液混合后100℃煮沸5min變性，采用10%的SDS-PAGE電泳、轉膜，加7.5%脫脂牛奶封閉2h，加抗Bax、Bcl-2、caspase-3和GAPDH抗體孵育過夜，TBST清洗3遍，每次5min，加熒光二抗孵育2h，TBST清洗后，Odyssey紅外熒光掃描系統掃描。采用Quantity One軟件分析條帶灰度變化。

結 果

1.DHM對PC12細胞活性和LDH釋放的影響:MTT結果顯示，H2O2對PC12細胞作用24h后，細胞存活率明顯下降，與對照組比較，模型組細胞存活率顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，DHM 10、20、40μmol/L劑量組細胞存活率顯著提高(圖1，P<0.01)。與對照組比較，模型組細胞上清液中的LDH含量顯著增高(P<0.01)，經DHM處理后，LDH含量顯著下降(P<0.05)，表明DHM顯著降低H2O2對PC12細胞的氧化損傷，詳見圖2。

2.Hoechst 33342觀察DHM對細胞凋亡的影響：正常對照組PC12細胞的細胞核輪廓完整，細胞大且細胞核呈圓形，而凋亡小體少。H2O2處理后PC12細胞核明顯固縮，DHM處理后細胞核固縮的細胞數量明顯減少(圖3A)。與對照組比較，H2O2組凋亡細胞百分比顯著增高，經DHM 10、20、40μmol/L處理后，細胞凋亡百分比顯著降低(圖3B，P<0.01)。

3.PC12細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達的影響:Western blot法結果顯示，與對照組比較， 模型組PC12細胞中Bax和caspase-3蛋白表達顯著增高，Bcl-2蛋白表達顯著降低；與模型組比較，DHM 10、20、40μmol/L組Bax和caspase-3蛋白顯著降低，Bcl-2蛋白顯著增高，Bax/Bcl-2比例顯著下降(圖4)。

圖1 二氫楊梅素對細胞存活百分比的影響與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P < 0.01

圖2 二氫楊梅素對乳酸脫氫酶活性的影響與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

圖3 Hoechst33342檢測細胞凋亡的影響A.Hoechst染色圖；B.凋亡率；與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；Bar=50μm

圖4 Western blot法檢測Bcl-2、Bax和caspase-3 表達的影響A.電泳圖；B.Bax/GAPDH;C.Bcl-2/GAPDH;D.Bax/Bcl-2/;E.caspase-3/GAPDH;與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01；與H2O2組比較，#P<0.05, ##P<0.01

討 論

二氫楊梅素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎抗氧化等藥理作用，尤其是抗氧化作用。多項研究證實，DHM通過抑制氧自由基的形成減少氧化應激誘導的細胞或組織損傷[5～7]。氧化應激增強誘導神經元凋亡壞死[8]。二氫楊梅素在中樞神經系統損傷中能夠緩解氧化應激引起的損傷，可能對神經退行性疾病的治療和預防發揮保護作用。本研究采用H2O2誘導PC12細胞氧化損傷，初步探討二氫楊梅素保護PC12細胞氧化損傷的效果與機制。

中樞神經系統細胞氧需求高且存在大量對過氧化反應敏感的細胞，特別容易受到活性氧損傷。氧化應激在阿爾茨海默病和帕金森病等神經退行性疾病發病過程中發揮非常重要的作用[9, 10]。神經退行性疾病無法治愈，神經元細胞逐漸退化死亡導致運動或精神障礙。盡管它無法治愈，但神經退行性變的進展可被天然氧化劑阻斷從而減緩神經元細胞的丟失。本研究采用MTT實驗證實不同濃度二氫楊梅素增加了PC12細胞的存活率，保護PC12細胞免受H2O2損傷。LDH含量是檢測細胞死亡的一個重要指標，H2O2誘導PC12細胞培養液中的LDH釋放增加，而二氫楊梅素處理后細胞培養液中的LDH水平明顯減少。上述實驗結果證實二氫楊梅素對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷具有很好的保護作用。

大量研究表明H2O2誘導多種神經細胞凋亡，細胞外H2O2過量使氧化還原失衡，誘發氧化應激導致細胞凋亡[11]。筆者采用Hoechst染色結果顯示，二氫楊梅素明顯降低細胞凋亡百分比，表明二氫楊梅素能明顯減輕H2O2誘導的細胞凋亡。Bcl-2是凋亡家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，與促凋亡蛋白Bax形成異源二聚體，作用于線粒體外膜，阻止線粒體釋放caspase，來影響細胞凋亡[12,13]。為進一步研究二氫楊梅素的抗凋亡作用機制，Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達的結果顯示，H2O2能夠顯著促進PC12細胞的Bax和caspase-3蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達下調，而二氫楊梅素能顯著抑制促凋亡蛋白Bax和caspase-3蛋白表達，誘導抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達上調。已有研究表明H2O2導致細胞毒性和caspase-3蛋白過表達，且多種黃酮類化合物通過抑制caspase-3減輕氧化應激誘導的細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明二氫楊梅素能夠增加H2O2誘導的PC12細胞存活率，抑制細胞凋亡，并通過抑制caspase-3蛋白和Bax/Bcl-2比例，實現保護PC12細胞氧化損傷的效果。氧化應激導致神經細胞損傷是許多神經退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等發病的重要機制。二氫楊梅素作為廣泛存在于天然植物的有效成分，對H2O2誘導PC12細胞的保護作用預示對神經退行性疾病的潛在療效，是一種重要的藥物前體成分。