姜黃素抑制胃癌多藥耐藥相關因子特性研究

隋欣 孫綱 盧光輝

[摘要] 目的 探討姜黃素抑制人胃癌SGC7901/ADR細胞增殖情況以及與多藥耐藥相關因子P170及GST-π表達規律的相關性。 方法 采用CCK-8檢測不同濃度姜黃素對SGC7901/ADR細胞12 h、24 h、36 h的抑制情況;通過免疫細胞化學法分析各濃度梯度姜黃素作用36 h時P170及GST-π的表達差異;采用統計學方法進行分析。 結果 姜黃素作用于人胃癌SGC7901/ADR耐藥細胞劑量越高、時間越長吸光度越低（P<0.05），各濃度梯度姜黃素作用36 h時GST-π陽性表達有降低趨勢，但無統計學意義（P>0.05），而與P170陽性表達則無直接關聯性。 結論 姜黃素可抑制人胃癌SGC7901/ADR耐藥細胞的增殖，可能抑制GST-π的表達。

[關鍵詞] 姜黃素;SGC7901/ADR細胞株;多藥耐藥;P170;GST-π

[中圖分類號] R735.2 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）10-0034-03

[Abstract] Objective To investigate the inhibition of Curcumin on the proliferation of human gastric cancer SGC7901/ADR cells and the relationship between Curcumin and the expression of multidrug resistance related factors P170 and GST-π. Methods Cell counting kit-8（CCK-8） was used to detect the inhibition of Curcumin at different concentrations on SGC7901/ADR cells for 12， 24 and 36 hours; immunocytochemistry was applied to analyze the differences of P170 and GST-π expression at 36 hours after Curcumin treatment at different concentrations; statistical method was used to analyze the results. Results The higher the dose of Curcumin on SGC7901/ADR cells and the longer the time， the lower the absorbance（P<0.05）. After 36 hours of Curcumin treatment at different concentrations， the positive expression of GST-π decreased， and the difference was not statistically significant（P>0.05）， and had no direct correlation with positive expression of P170. Conclusion Curcumin can inhibit the proliferation of SGC7901/ADR cells， and may inhibit the expression of GST-π.

[Key words] Curcumin; SGC7901/ADR cell line; Multidrug resistance; P170; GST-π

近年來相關研究表明，從中草藥姜黃中分離出的多酚-姜黃素（Curcumin）對胃癌的治療具有積極意義，特別是其對化學治療的增效性及抗耐藥性[1]。胃癌是我國發病率及死亡率很高的消化道惡性腫瘤，但目前其治療效果仍不理想，主要原因是腫瘤所具備的多藥耐藥特性（multi-drug resistance，MDR）[2]。多藥耐藥是腫瘤細胞先天或后天具有對某種抗腫瘤藥物的耐藥特性，而且可能對其他結構特征、干擾機制、靶目標不盡相同的其他類型抗腫瘤藥物具有耐藥特性。經相關研究證實，其主要作用因子包括已知的P170和GST-π等，可多角度、多靶點干預胃癌的進程和預后，以及胃癌對化學藥物MDR的強度，是近年腫瘤耐藥及多藥耐藥的集中因子[3]。正是基于上述原因，我們著手研究姜黃素對胃癌多藥耐藥的抑制作用，從而為中草藥抗腫瘤特別是胃癌的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源

胃癌耐藥細胞株SGC7901/ADR（第四軍醫大學西京醫院全軍消化病研究所）;姜黃素（Curcumin，C21H20O6=368.38）純度≥65%（ALADDIN）。

1.2 方法

1.2.1 采用CCK-8法檢測細胞增殖情況 ?于培養孔板每孔中分別加入100 μL濃度為5×104/mL對數生長期細胞，置37℃、5% CO2培養箱中培養8 h，預留等比空白組。將姜黃用培養基等比稀釋成細胞濃度梯度為0 μmol/L（對照組）、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L溶液，然后加到培養孔板中，每孔100 μL，每個濃度18個復孔（備份培養供進一步免疫細胞化學法分析使用）分別培養12、24、36 h，每孔加入CCK-8后采用酶標儀測定吸光度值（波長450 nm）。

1.2.2 免疫細胞化學法分析各濃度梯度姜黃素作用36 h時P170及GST-π的表達差異 ?選擇實驗時間組別姜黃素干預最充分的36 h時間點，按各梯度濃度組別從孵箱中取出培養36 h的細胞，用含EDTA的胰酶消化，分別取2 mL細胞懸液滴于培養孔板中，放入37℃、5% CO2孵箱中培養備用。清洗、固定、去除內源性過氧化物酶并濕盒室溫孵育。將標本加入適量對應抗體1：100稀釋，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯浸泡并中性樹膠封片。

顯微鏡下逐一觀察，陽性判斷標準為：選用已知陽性平片作對照，P170主要表達于細胞膜和細胞質，GST-π主要表達于細胞質，染色成棕黃色顆粒且間質不染色表達為陽性，染色強度依次定為棕褐色（+++）、棕黃色（++）、淡黃色（+）[4]。

1.3 統計學分析

使用SPSS17.0分析軟件進行統計學處理分析，各數據經正態性檢驗，非正態分布的資料經轉換后比較，各計量資料采用（x±s）表示，兩組組間比較采用LDS-t檢驗，多組間比較采用方差分析，各濃度梯度姜黃素與P170及GST-π表達的相關性采用Spearman法分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素梯度濃度及時間對胃癌耐藥SGC7901/ADR細胞株的影響

隨時間及劑量梯度變化，姜黃素濃度及作用時間與吸光度呈反比，既抑制了胃癌耐藥SGC7901/ADR細胞株的增殖，且差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 各濃度梯度姜黃素與P170及GST-π表達的相關性

姜黃素濃度強度分別對應為0 μmol/L（-）、50 μmol/L（+）、100 μmol/L（++）、150 μmol/L（+++）。充分培養36 h后，隨濃度升高，GST-π陽性表達率均出現下降趨勢，但采用Spearman法進行統計學分析后，差異無統計學意義（P>0.05），無明確相關性;而P170陽性表達率無明確相關變化趨勢，見表2、3。

3討論

腫瘤的多藥耐藥是腫瘤細胞本身具有的對特定抗腫瘤藥物產生耐藥的同時對其結構、作用機制、作用目標不盡相同的其他抗腫瘤藥物存在耐藥的特性[5]。多藥耐藥的發生機制較為復雜，已知可能的原因為：①跨膜轉運引起的藥物分子細胞內外分布失調，導致藥物分子外泄;②調節細胞器靶點分布，從而隱藏藥物靶點;③LRP的類膜泵效應胞吐藥物分子;④細胞的自我修復過表達;⑤細胞的藥物靶點突變，降低其對藥物敏感性;⑥PKC過表達，促進相關蛋白磷酸活化;⑦凋亡基因的影響等[6]。有多種蛋白、信號通道及生物酶參與其中。如何減輕、抵消甚至逆轉多藥耐藥，從而加強化學治療的療效，提升化學治療的預后，已成為目前癌癥治療研究的重點之一[7]。特別是嚴重危害我國人民健康的胃癌，其手術后多需化學治療，但其療效同樣受困于多藥耐藥的影響。P170、GST-π作為多藥耐藥基因的產物已被廣泛證實與胃癌的多藥耐藥關系密切，可影響胃癌等腫瘤對化學治療的多藥耐藥進程[6]。其中起到介導媒體的P170，對基因在多藥耐藥層面的重組、轉錄起到正向作用;而GST-π是一種廣泛參與機體解毒的與蛋白結合的同工酶，一方面加強細胞毒的溶水性，將其代謝成為沒有毒性的物質排出，又對細胞的自我修復起到指導作用，除去對細胞積極作用外，也導致了多藥耐藥的強勢[8]。P170、GST-π均是明確的多藥耐藥相關因子。實際上MDR因素很多，且某些MDR因子還存在雙刃劍機制，如p38MAPK信號通路等，他們聯合或孤立對包括胃癌在內的消化道腫瘤的進程及后續化學治療的療效起著重要的作用，也是腫瘤多藥耐藥的研究高地[3，9]。

近年來隨著中醫腫瘤學的深入發展，中醫藥對腫瘤多藥耐藥的調控及影響作用已得到了公認，并轉化為臨床實踐取得了較好的療效[10]。姜黃是一種具有歷史藥用價值的中草藥，具有行氣破淤、通經止痛的功效。而姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚類色素，具有抗氧化、促凋亡、化療增敏、抗血管生成、抗腫瘤等生物活性，可直接或間接地影響多藥耐藥的進程，臨床及基礎研究均提示其聯合化療藥物在抗腫瘤治療中已取得了正面效果[11]。目前尋求高效、低毒的逆轉多藥耐藥的方法已成為研究的熱點。實際上引起腫瘤多藥耐藥的機制比較復雜，但中藥以資源豐富、含有多種逆轉多藥耐藥的活性成分、作用靶點多，而引起了廣泛關注。特別是近年來以姜黃素為代表的中藥提取物的相關研究更是取得了突破性的進展。姜黃素具有抗癌譜廣、毒副作用小等優點，可從凋亡、干擾多藥耐藥、增強化療效果、影響滋養血管形成等多角度抗腫瘤，自1985年起就被相關研究揭示可抑制食管癌、胃癌、肝癌等相關細胞系[12-14]，同時已被美國國立腫瘤研究所列為腫瘤第三代化學預防劑[15]。但姜黃素對多藥耐藥作用的機制仍不完全明確，特別是腫瘤發展各階段可直接進行微觀干預的信號通路、蛋白等角度研究較為稀少，不利于其廣泛的臨床應用及推廣。

正是基于上述原因本研究通過探討姜黃素抑制人胃癌SGC7901/ADR細胞增殖情況以及過程中與多藥耐藥相關因子P170、GST-π表達規律的相關性，本研究在一定程度上揭示了姜黃素對胃癌多藥耐藥的抑制作用，既姜黃素的濃度及作用時間抑制SGC7901/ADR細胞株的增殖，差異具有統計學意義;隨姜黃素濃度升高GST-π陽性表達率均出現下降趨勢，但差異無統計學意義;而與P170則無直接關聯性，這可能與實驗樣本較少及各細胞株獨特性有關，待進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] Kang Y，Hu W，Bai E，et al.Curcumin sensitizes human gastric cancer cells to 5-fluorouracil through inhibition of the NFκB survival-signaling pathway[J].Onco Targets Ther，2016，9：7373-7384.

[2] 蔡朋朋，王東紅，李雪松，等.As2O3及聯合紫杉醇對胃癌MGC803細胞的生長和耐藥性的影響[J].中國現代醫生，2013，51（29）：4-6，10.

[3] 張慧，符立梧.多藥耐藥相關蛋白及其在腫瘤耐藥中的作用[J].藥學學報，2011，46（5）：479-486.

[4] Houghton JM，Wang T. Tumors of the stomach[M]//Feldman M，Friedman L，Brandt U.Sleisenger and Fordtrans gastrointestinal and liver disease[M]. 8th ed. Amsterdam：Saunders/Elsevier，2006：1139-1156.