VTA Nesfatin-1信號通路參與調節糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感神經元活動 ?

梁琰 冷慧 徐珞

【摘要】 目的：探究大鼠腹側背蓋區（VTA）微量注射nesfatin-1對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感神經元活動的影響。方法：通過向VTA微量注射nesfdatin-1及黑皮質素3/4受體拮抗劑SHU9119觀察對正常大鼠及糖尿病大鼠葡萄糖敏感（GS）神經元放電活動的影響;通過綜合實驗室動物監測系統（CLAMS，Columbus Instruments，Ohio）觀察向VTA微量注射nesfdatin-1及黑皮質素3/4受體拮抗劑SHU9119對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食的影響。結果：VTA微量注射nesfatin-1后，正常大鼠和糖尿病大鼠GS-E神經元放電活動顯著升高（P<0.05），且GS-I神經元放電活動顯著下降（P<0.05），但糖尿病大鼠VTA注射nesfatin-1對GS反應性神經元的興奮/抑制作用更加顯著（P<0.05）;VTA微量注射nesfatin-1后，正常大鼠和糖尿病大鼠攝食量均顯著下降（P<0.05），但糖尿病大鼠攝食量下降更為顯著（P<0.05）。結論：大鼠VTA nsfatin-1信號通路參與正常大鼠及糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經元放電活動及攝食量的調控。

【關鍵詞】 腹側背蓋區 Nesfatin-1 糖尿病大鼠 攝食 葡萄糖敏感神經元

[Abstract] Objective： To investigate the effects of microinjection of nesfatin-1 into ventral dorsal tegmental area （VTA） on the feeding and glucose sensitive neuron activities in normal and diabetic rats. Method： The effects on the activity of glucose sensitive （GS） neurons in normal and diabetic rats were observed by microinjection of nesfatin-1 and melanocortin 3/4 receptor antagonist SHU9119 into VTA， the effects of microinjection of nesfdatin-1 and melanocortin 3/4 receptor antagonist SHU9119 into VTA on the feeding of normal and diabetic rats were observed by means of the integrated laboratory animal monitoring system （CLAMS， Columbus Instruments， Ohio）. Result： VTA neuronal firing activity increased significantly in normal and diabetic rats after microinjection nesfatin-1 （P<0.05）， and decreased significantly in GS-I neurons （P<0.05）， but the excitatory/inhibitory effect of injection nesfatin-1 on GS reactive neurons was more significant in diabetic rats （P<0.05）. After VTA microinjection of nesfatin-1， both normal and diabetic rats decreased significantly （P<0.05）， but the food intake of diabetic rats decreased more significantly （P<0.05）. Conclusion： The signal pathway of VTA nsfatin-1 is involved in the discharge activity of glucose sensitive neurons and the change of food intake in normal and diabetic rats.

2006年，研究人員發現一種新的腦腸肽，命名為nesfatin-1[1]。Nesfatin-1是由前體蛋白2（NUCB2）衍生而來的一種含有82個氨基酸的多肽[2-3]。Nesfatin-1起初被發現與攝食相關，分布于大鼠下丘腦腹側背蓋區（VTA）、室旁核（PVN）、弓狀核（ARC）和孤束核（NTS）等[1]。后續研究發現，nesfatin-1具有廣泛的中樞和外周分布，且參與調節胃腸功能、糖和脂類代謝、能量代謝、情緒調節及心血管功能等[4-6]。

研究發現，體重的慢性改變也會影響nesfatin-1血清循環水平，在體重偏輕和厭食癥患者體內nesfatin-1水平降低[7-8]，但在肥胖患者體內，nesatin-1的血清循環水平升高，可能是因為nesfatin-1在胃中表達增加有關，在胃切除等減肥手術后，患者體重下降，且nesfatin-1循環水平下降[9-10]，這表明nesfatin-1與體重存在負相關。先前研究主要集中在外周或靜脈注射nesfatin-1對大鼠攝食及能量代謝的影響，而本研究通過向大鼠下丘腦腹側背蓋區（VTA）直接微量注射nesfatin-1，觀察對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感（GS）神經元放電活動的影響，對糖尿病的疾病進展及臨床靶向藥物的研發具有重要意義，具體如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性Sprague Dawley大鼠，體質量在220～250 g，均在室溫（25±2）℃、12 h∶12 h晝夜循環光照、實驗室標準飲食及自由進食和飲水的環境中飼養。實驗開始前，大鼠禁食24 h，但可自由飲水。VTA內注射藥物后，大鼠自由攝食和飲水。所有動物實驗均嚴格按《青島大學實驗動物保護和使用管理辦法》執行。

1.2 糖尿病大鼠模型制備

隨機選取70只大鼠，體重220～250 g，禁食12 h，不禁水。模型組大鼠單次腹腔注射35 mg/kg的鏈脲佐菌素（STZ，sigma）。STZ用滅菌0.1 mmol/L、pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成2%的溶液，現配現用。72 h后取尾靜脈血測空腹血糖高于7.0 mmol/L和餐后血糖均高于11.1 mmol/L為糖尿病大鼠建模成功。未成模者或成模后緩解者淘汰。

1.3 大鼠腦核團置管

大鼠腹腔注射10%水合氯醛 （0.3 ml/100 g）麻醉，固定于腦立體定位儀，根據Paxinos&Watson大鼠腦圖譜用微量注射儀定位，以前囟為零點，定位大鼠下丘腦腹側被蓋區（VTA，前囟后5.2 mm，旁開1.0 mm，深8.0 mm）。用牙科鉆鉆孔，將一不銹鋼套管置于VTA，用牙科粘固劑固定，不銹鋼管探針封閉導管，縫合頭皮切口。大鼠分籠飼養，自由飲食飲水。手術結束后大鼠連續3 d給予腹腔注射8萬U青霉素以防止術后感染。大鼠恢復1周后開始實驗。

為了檢測核團或側腦室定位是否準確，實驗結束后經套管向大鼠VTA內緩慢注射滂胺天藍溶液，隨后麻醉大鼠，經心臟灌注固定，斷頭取腦，50 μm冠狀冰凍切片，顯微鏡下觀察藥物注射的位置是否準確。

1.4 葡萄糖敏感神經元放電

為了檢測nesfatin-1對正常大鼠和糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經元放電的影響，隨機選取正常大鼠和糖尿病大鼠各30只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100g）麻醉，并固定于腦立體定位儀，暴露顱骨，參照大鼠腦圖譜定位VTA（前囟后5.2 mm，旁開1.0 mm，深8.0 mm）。牙科鉆顱骨鉆孔，剝除腦膜暴露腦實質，使用 30～40 g/L 的瓊脂生理鹽水覆蓋腦表面。將五管玻璃微電極（電極尖端直徑 15～20 μm，電極阻抗 5～15 MΩ）用液壓推進器送至VTA。在五管玻璃微電極中：記錄電極充以20 g/L的滂胺天藍和0.5 mmol/L乙酸鈉，另外四管分別充以5 mmol/L葡萄糖（pH 7.4）、0.9%生理鹽水（NS），10 nmol/L nesfatin-1和1 nmol/L SHU9119，與四通液壓推進泵相連。注射葡萄糖（GS）后，其中部分神經元對GS有反應，被鑒定為GS反應神經元。因此，將GS反應神經元作為后續電生理實驗基礎。通過短脈沖氣壓（1 500 ms， 5.0～15.0 psi）向GS反應神經元表面先后噴灑0.9%生理鹽水（NS），10 nmol/L nesfatin-1、1 nmol/L SHU9119和10 nmol/L nesfatin-1+1 nmol/L SHU9119，待前一藥物作用消失后，再噴灑后一藥物，觀察不同藥物對大鼠GS反應神經元放電活動的影響。

當玻璃微電極尖端進入空氣與瓊脂界面時，監聽器的聲音會發生明顯的變化。當玻璃微電極進入VTA，搜尋VTA內神經元，并開始記錄細胞外的放電活動。待放電頻率穩定后（至少記錄120 s），注入5 mmol/L葡萄糖（pH 7.4），觀察神經元放電頻率的變化，鑒別GS神經元，以神經元放電頻率的變化率超過20%作為神經元興奮或抑制指標，神經元表現興奮的定為葡萄糖興奮性（GE）神經元，表現為抑制的定為葡萄糖抑制性（GI）神經元。之后注射藥物，觀察藥物對GS神經元放電頻率的影響。

1.5 攝食量測定

為了檢測nesfatin-1對正常大鼠和糖尿病大鼠攝食量的影響，另隨機選取正常大鼠和糖尿病大鼠各20只，各分為4組，每組5只，分別為NS組（0.5 μl NS）、Nesfatin-1組（0.5 μl 0.5 μg nesfatin-1）、SHU9119組（0.5 μl 0.25 μg SHU9119）、nesfatin-1+SHU9119組（0.5 μl 0.5 μg nesfatin-1+ 0.5 μl 0.25 μg SHU9119）。

大鼠被安置[平均體重（205±3）g]，并使其適應環境。實驗開始前，大鼠禁食12 h，不禁水。在核團給藥之前記錄大鼠的體重。將大鼠轉移至綜合實驗室動物監測系統（CLAMS;Columbus Instruments，Ohio）籠中以適應環境，并在第一次研究之前監測飼養和代謝參數4 d。分別記錄大鼠0～4 h每小時攝食量。使用與第一組大鼠體重匹配的第二組大鼠重復進行實驗，獲得相似的結果。

1.6 統計學處理

采用SPSS 18.0和PPMS 1.5軟件分析數據，計量資料均以（x±s）表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，兩組間樣本均數比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VTA注射nesfatin-1對正常大鼠GS敏感神經元放電活動的影響

在30只正常大鼠VTA共記錄到88個放電神經元，其中64個（72.73%，64/88）神經元對GS有反應，被鑒定為GS反應神經元。在64個GS反應神經元中，35個（54.69%，35/64）神經元放電頻率顯著增加，鑒定為GS-E神經元;而29個（45.31%，29/64）神經元放電頻率下降，鑒定為GS-I神經元。

在35個GS-E神經元中，nesfatin-1組中神經元（65.71%，23/35）放電頻率高于NS組（P<0.05），平均升高（84.95±7.59）%，見表1、圖1B;若VTA微量注射黑皮質素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導的興奮效應（P<0.05），見表1、圖1A;單獨注射SHU9119，正常大鼠VTA GS-E反應神經元放電活動無顯著改變（P>0.05），見表1、圖1A。

在29個GS-I神經元中，nesfatin-1組中神經元放電頻率低于NS組（P<0.05），平均降低（48.74±2.19）%，見表1、圖1B。Nesfatin-1對正常大鼠GS-I神經元的抑制作用可被預先VTA注射SHU9119部分阻斷（P<0.05），見表1、圖1B。提示，nesfatin-1可能通過黑皮質素3/4受體通路參與調控正常大鼠VTA GS-E或GS-I神經元的興奮性，單獨注射SHU9119，正常大鼠VTA GS-E反應神經元的放電活動無顯著改變（P>0.05），見表1、圖1B。

2.2 VTA注射nesfatin-1對糖尿病大鼠GS敏感神經元放電活動的影響

在30只糖尿病大鼠VTA共記錄到94個放電神經元，其中67個（71.28 %，67/94）神經元對葡萄糖有反應，被鑒定為GS反應神經元。在67個GS反應神經元中（GS組），39個（58.21%，39/67）神經元放電頻率顯著增加，鑒定為GS-E神經元;而28個（41.79%，28/67）神經元放電頻率下降，鑒定為GS-I神經元。

在39個GS-E神經元中，nesfatin-1組中神經元（66.67 %，26/39）放電頻率高于NS組（P<0.05），平均升高（98.10±9.14）%，見表2、圖2A;若VTA微量注射黑皮質素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導的興奮效應（P<0.05），見表2、圖2A，單獨注射SHU9119，糖尿病大鼠VTA GS-E反應神經元的放電活動無顯著改變（P>0.05），見表2、圖2A。

在28個GS-I神經元中，nesfatin-1組中神經元放電頻率低于NS組（P<0.05），平均降低（59.90±3.09）%，見表2、圖2B。Nesfatin-1對糖尿病大鼠GS-I神經元的抑制作用可被預先VTA注射SHU9119部分阻斷（P<0.05），見表2、圖2B。提示，nesfatin-1可能通過黑皮質素3/4受體通路參與調控糖尿病大鼠VTA GS-E或GS-I神經元的興奮性，單獨注射SHU9119，糖尿病大鼠VTA GS-E反應神經元的放電活動無顯著改變（P>0.05），見表2、圖2B。

2.3 VTA注射nesfatin-1對正常和糖尿病大鼠GS敏感神經元放電頻率變化率比較

為進一步比較正常及糖尿病大鼠VTA注射nesfatin-1對大鼠GS反應神經元放電活動的影響，本研究以放電頻率變化率對放電頻率的變化進行量化[放電頻率變化率（%）=（放電頻率nesfatin-1-放電頻率NS）/放電頻率NS×100%]。結果顯示，與正常大鼠nesfatin-1組相比，nesfatin-1對糖尿病大鼠GS-E神經元的興奮效應顯著增加（P<0.05），見圖1C、圖2C、表3;且nesfatin-1對糖尿病大鼠GS-I神經元的抑制作用明顯強于正常大鼠（P<0.05），見圖1C、圖2C、表3。

2.4 VTA注射nesfatin-1對正常和糖尿病大鼠攝食量的影響

在正常大鼠，與NS組相比，VTA微量注射nesfatin-1，大鼠0～4 h每小時攝食量顯著降低（P<0.05），見表4。若VTA預注射SHU9119，nesfatin-1的抑攝食效應部分消失（P<0.05），見表4，即nesfatin-1對攝食的抑制作用可能是通過黑皮質素3/4受體信號通路而實現的。而單獨注射SHU9119對大鼠攝食無顯著影響（P>0.05），見表4。

在糖尿病大鼠，與NS組相比，VTA微量注射nesfatin-1，大鼠0～4 h每小時攝食量顯著降低（P<0.05），見表4。若VTA預注射SHU9119，nesfatin-1抑攝食效應部分消失（P<0.05），見表4，即nesfatin-1對攝食的抑制作用可能是通過黑皮質素3/4受體信號通路而實現的。而單獨注射SHU9119對糖尿病大鼠攝食無顯著影響（P>0.05），見表4。

對兩組大鼠攝食量改變量進行比較，正常大鼠攝食改變量=（攝食量正常大鼠nesfatin-1組-攝食量正常大鼠NS組）/攝食量正常大鼠NS組;糖尿病大鼠攝食改變量=（攝食量糖尿病大鼠nesfatin-1組-攝食量糖尿病大鼠NS組）/攝食量糖尿病大鼠NS組。結果顯示，與正常大鼠相比，VTA微量注射nesfatin-1，糖尿病大鼠攝食量降低更顯著（P<0.05），見表5。

3 討論

先前研究報道，nesfatin-1在葡萄糖穩態中也發揮重要作用，nesfatin-1除了在胃中大量表達外，還在嚙齒動物、狗、豬和人類中也檢測到nesfatin-1在胰腺內分泌小島中與胰島素存在共定位[11-19]，表明nesfatin-1與糖尿病的發生發展過程存在密切關系。因此，本研究探究了大鼠VTA nesfatin-1信號通路對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感（GS）神經元放電活動的影響。

本研究結果顯示，大鼠VTA微量注射nesfatin-1可使正常大鼠及糖尿病大鼠GS-E神經元放電頻率顯著升高，而使GS-I神經元放電頻率顯著降低;若VTA微量注射黑皮質素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導的興奮/抑制效應，單獨注射SHU9119，對正常及糖尿病大鼠VTA GS反應神經元的放電活動無顯著改變。提示，nesfatin-1可能是通過SHU9119受體信號通路參與對正常大鼠及糖尿病大鼠GS反應性神經元放電活動的調控。更重要的是，與正常大鼠相比，向糖尿病大鼠VTA微量注射nesfatin-1，對糖尿病大鼠GS反應性神經元放電活動的興奮/抑制效應更加顯著。先前研究已知，糖尿病與肥胖等相關疾病關系密切[20]，而本研究結果提示，正常大鼠及糖尿病大鼠體重攝食或體重差異可能與大鼠下丘腦VTA中GS反應性神經元激活有關。

此外，本研究還發現，向大鼠VTA微量注射nesfatin-1，正常及糖尿病大鼠0～4 h每小時攝食量顯著降低。若VTA預注射SHU9119，nesfatin-1的抑攝食效應部分消失，即nesfatin-1對攝食的抑制作用可能是通過黑皮質素3/4受體信號通路而實現的。而單獨注射SHU9119對正常及糖尿病大鼠攝食無顯著影響。此外，對兩組大鼠攝食量改變結果組間比較可見，與正常大鼠相比，VTA微量注射nesfatin-1，糖尿病大鼠的攝食量降低更為顯著。提示，nesfatin-1可能是通過SHU9119受體信號通路參與對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食量的調控。

已知nesfatin-1具有廣泛的中樞及外周調控，因此探究nesfatin-1在中樞對糖、脂及能量代謝相關障礙疾病的調控具有重要的臨床意義。本研究中觀察到nesfatin-1可通過SHU9119受體信號通路參與對糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經元放電及攝食的調控，這可能為未來代謝相關疾病的臨床治療提供新的思路。

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（收稿日期：2019-12-05） （本文編輯：馬竹君）