產長春新堿尖孢鐮刀菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究

魏 欣，王曉麗

(江蘇省腫瘤醫(yī)院 江蘇省腫瘤防治研究所 南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

長春新堿(vincristine，VCR)是一種雙吲哚生物堿[1]，發(fā)現(xiàn)于夾竹桃科長春花(Catharanthulsroseus)中[2-3]。VCR是目前應用較廣、效果較好的抗癌藥物[4]，通過干擾腫瘤細胞微管蛋白合成從而影響腫瘤細胞的活性，主要治療何杰金及非何杰金淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病、支氣管肺癌、乳腺癌(如組織肉瘤)[5-6]等。目前，VCR主要從長春花中提取，但提取工作量大、提取效率低，同時破壞生態(tài)環(huán)境[7-8]。根據(jù)植物內生真菌和真菌的協(xié)同進化[9-11]，從長春花中篩選出6株可以合成長春新堿的內生真菌，其中FN-06產VCR的能力較強，但產量較低，只有1.16 mg·L-1。FN-06經鑒定為半知菌類(Imperfecti fungi)、從梗孢目(Moniliales)、鐮刀菌屬(Fusarium)。為提高尖孢鐮刀菌產VCR的能力，對菌種進行了紫外線和亞硝基胍復合誘變[12-15]，通過分離純化最終篩選出1株產量可達16.24 mg·L-1的菌株，命名為FN-06-01。作者采用單因素實驗和響應面實驗對尖孢鐮刀菌FN-06-01在10 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，擬提高VCR產量，為以后相關研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

可溶性淀粉，上海埃彼化學試劑有限公司；玉米漿，山東新浦生物科技有限公司；酵母膏、葡萄糖、蛋白胨，分析純，北京百奧萊博科技有限公司；KNO3、K2HPO4、KCl、(NH4)2SO4，分析純，北京鵬彩精細化工有限公司；瓊脂粉，分析純，北京亞米生物科技有限公司；消泡劑，分析純，江蘇長豐有機硅有限公司；馬鈴薯，市售。

SW-CJ-1型單人單面超凈工作臺，蘇州艾克利凈化設備有限公司；ZSH-100型生化培養(yǎng)箱，上海喆圖科學儀器有限公司；HNY-200B型恒溫搖床，河南鑫貝西生物技術有限公司；BKQ-B75L型高壓滅菌鍋，上海喬躍電子科技有限公司；JC-AME型玻璃生物發(fā)酵罐(10 L)，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司；TG20-WS型臺式高速離心機，上海梓桂儀器有限公司；Agilent1260型高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)FN-06-01，自備。

斜面培養(yǎng)基[16]：PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基[17]：PDB培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基[18]：可溶性淀粉 80 g·L-1，玉米漿18 g·L-1，KNO32.0 g·L-1，KH2PO40.6 g·L-1，KCl 5 g·L-1，(NH4)2SO41.5 g·L-1，消泡劑0.1 g·L-1，雙蒸水1 000 mL,pH值 6.8～7.0；121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

取超低溫保藏的菌種FN-06-01接種到PDA培養(yǎng)基進行活化，于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)6 d，加入無菌生理鹽水，得2.6×107個·mL-1孢子懸液。將孢子懸液接種到250 mL裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫搖床，28 ℃、120 r·min-1下培養(yǎng)3 d，即得種子液。

1.3.2 單因素實驗

將種子液按無菌操作要求接種至10 L玻璃生物發(fā)酵罐中，采用單因素實驗分別考察發(fā)酵溫度、初始pH值、通氣量和接種量等因素對VCR產量的影響。

1.3.3 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，選取對VCR產量影響顯著的4個因素發(fā)酵溫度(X1)、初始pH值(X2)、通氣量(X3)和接種量(X4)為自變量，以VCR產量(Y)為響應值，根據(jù)Box-Behnken 設計原理[19-21]，進行4因素3水平響應面分析，響應面實驗的因素與水平見表1。

表1響應面實驗的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of response surface methodologies

1.3.4 VCR含量測定

參照文獻[22-23]方法測定VCR含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

用Design Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行線性回歸和方差分析[24-25]，通過SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發(fā)酵溫度對VCR產量的影響(圖1)

圖1 發(fā)酵溫度對VCR產量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on VCR production

從圖1可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，VCR產量呈先升高后降低的趨勢；當發(fā)酵溫度在28～30 ℃范圍內，VCR產量基本保持不變，說明在這個溫度范圍內，尖孢鐮刀菌FN-06-01產VCR量較高且很穩(wěn)定。可能是因為，當發(fā)酵溫度在28～30 ℃范圍內時，尖孢鐮刀菌FN-06-01合成VCR的酶系活性最高，當發(fā)酵溫度低于或高于這個范圍，酶系活性下降。因此，尖孢鐮刀菌FN-06-01的最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.1.2 初始pH值對VCR產量的影響(圖2)

圖2 初始pH值對VCR產量的影響Fig.2 Effect of initial pH value on VCR production

從圖2可以看出，當初始pH值在5.5～6.5時，VCR產量較高且穩(wěn)定；初始pH值小于5.5或大于6.5時，VCR產量均呈迅速下降的趨勢。可能是因為，初始pH值在5.5～6.5范圍內，尖孢鐮刀菌FN-06-01合成VCR的酶系活性最高，低于或高于這個范圍，酶系活性均迅速下降。因此，尖孢鐮刀菌FN-06-01的最適初始pH值為6.0。

2.1.3 通氣量對VCR產量的影響(圖3)

圖3 通氣量對VCR產量的影響Fig.3 Effect of aeration rate on VCR production

從圖3可以看出，當通氣量從3.0 L·min-1增加到5.0 L·min-1的過程中，VCR產量呈直線上升趨勢；當通氣量超過5.0 L·min-1時，VCR產量迅速下降。可能是因為，尖孢鐮刀菌FN-06-01是好氧菌，當發(fā)酵液中溶氧逐漸增加，VCR產量會迅速上升，但溶氧過多時會造成菌種代謝速率迅速加快從而使pH值迅速減小，造成VCR產量迅速下降。因此，尖孢鐮刀菌FN-06-01的最適通氣量為5.0 L·min-1。

2.1.4 接種量對VCR產量的影響(圖4)

圖4 接種量對VCR產量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on VCR production

從圖4可以看出，當接種量在7.0%～8.0%范圍內，VCR產量較高且穩(wěn)定；當接種量低于7.0%或高于8.0%時，VCR產量均迅速下降。可能是因為，正常發(fā)酵生產需要一定的菌種濃度，菌種濃度過低，合成能力較小，但如果菌種濃度過高而又沒有相應的培養(yǎng)條件，如增加新鮮培養(yǎng)基等，那么菌種之間就會造成不良的競爭從而降低產物的合成能力。因此，尖孢鐮刀菌FN-06-01的最適接種量為7.0%。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 回歸模型建立

利用Box-Behnken進行4因素3水平響應面實驗，結果見表2。

2.2.2 回歸模型方差分析(表3)

2.2.3 響應面分析

發(fā)酵溫度、初始pH值、通氣量和接種量等4個因素的交互作用對尖孢鐮刀菌FN-06-01產VCR量的影響的響應面圖見圖5。

表2 響應面實驗結果

Tab.2 Results of response surface methodologies

表3回歸模型方差分析

Tab.3 Variance analysis of regression model

注：*表示對結果影響顯著(P<0.05)；**表示對結果影響極顯著(P<0.01)。

圖5 各因素交互作用對VCR產量影響的響應面圖Fig.5 Response surface map for effect of interaction between each factor on VCR production

從圖5可以看出，4個因素對VCR產量影響的大小順序為：發(fā)酵溫度>初始pH值>接種量>通氣量，與表3方差分析結果相符。從等高線可以看出，發(fā)酵溫度和初始pH值的交互作用以及發(fā)酵溫度和接種量的交互作用對VCR產量影響極顯著，與表3方差分析結果一致。

2.3 驗證實驗

采用Design Expert 8.0.6軟件對二次多項式回歸方程求解，得到尖孢鐮刀菌FN-06-01產VCR的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28.16 ℃、初始pH值6.18、通氣量5.24 L·min-1、接種量7.45%，預測VCR產量為23.95 mg·L-1。考慮實際發(fā)酵情況，最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28.0 ℃、初始pH值6.0、通氣量5.0 L·min-1、接種量7.5%，在此條件下，進行3次驗證實驗， VCR平均產量為24.61 mg·L-1，比優(yōu)化前提高了51.54%，和預測值非常接近，表明回歸模型和實際情況擬合度較好。

3 結論

采用單因素實驗和響應面實驗對實驗室篩選且通過復合誘變的尖孢鐮刀菌FN-06-01在10 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28.0 ℃、初始pH值6.0、通氣量5.0 L·min-1、接種量7.5%，在此條件下，長春新堿產量達到24.61 mg·L-1，較優(yōu)化前提高了51.54%。該研究所構模型可顯著提高尖孢鐮刀菌FN-06-01發(fā)酵產VCR量，為規(guī)模化生產提供了理論和實踐基礎。