長鏈非編碼核糖核酸GAS8-AS1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達

樊大貝，張好好

(鄭州大學第一附屬醫院內分泌科，河南 鄭州 450052)

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤之一，占總體惡性腫瘤病例數量的1%～2%。隨著人類生活水平明顯提高，世界范圍內甲狀腺癌的發病率也呈現逐年上升的趨勢[1]。其中，甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌的一個常見類型，大約占總甲狀腺癌病例數量的80%[2]。這類疾病具有發病隱匿性的特點，往往因早期癥狀輕，病情穩定，不易引起重視，以至于后期延誤治療，造成患者及其家屬生活、醫療、工作成本負擔加劇。因此，需要對患者盡早的診斷和治療。臨床上通常采用細針穿刺活檢方式進行細胞病理學分析，以判斷甲狀腺乳頭狀癌的診斷，但是這種方法也存在一定的局限性，因此，需要用其他更先進的方式進行甲狀腺乳頭狀癌的診斷。

長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid, lncRNA)是一類大于200個核苷酸的RNA，本身無蛋白質編碼功能，但對于調節基因功能和細胞增殖具有十分重要的作用[3]。lncRNA可以調節染色體結構、轉錄活性、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)穩定性、mRNA轉錄后加工、mRNA翻譯等各類生物過程[4]。在惡性腫瘤的早期診斷和預后評估中，lncRNA可以作為一類新型的生物標志物應用。Zhang等[5]研究發現，lncRNA GAS8-AS1可以作為甲狀腺乳頭狀癌診斷的一種重要生物標志物，但是在臨床上并沒有得到有效證實。鑒于此，本研究通過對81例甲狀腺乳頭狀癌患者進行病理學結合lncRNA GAS8-AS1表達分析，探討lncRNA GAS8-AS1在甲狀腺乳頭狀癌鑒別診斷及預后評估中的臨床價值，為甲狀腺乳頭狀癌的快速有效診斷提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象納入2013年1月至2018年2月鄭州大學第一附屬醫院收治的經臨床病理學確診的甲狀腺乳頭狀癌患者81例作為試驗組。此外，選取2015年12月至2018年4月鄭州大學第一附屬醫院收治的經臨床病理學確診的結節性甲狀腺腫患者66例作為對照組。2組患者的年齡、性別等一般臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經過鄭州大學附屬第一醫院的倫理委員會批準，且所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品收集 甲狀腺乳頭狀癌患者的血液樣品在患者術前禁食條件下和術后1 a禁食條件下進行收集，每例患者抽取約10 mL靜脈血至含有乙二胺四乙酸的采集管中。血液收集后1 h內在4 ℃、12 000 g條件下離心10 min，將上清液轉移至滅菌的離心管中，樣品經過分光光度計檢測合格后加入適量Trizol(美國Invitrogen公司)后儲存在-80 ℃條件下備用。對照組的結節性甲狀腺腫患者同樣按照上述方法采集血液。甲狀腺乳頭狀癌患者的腫瘤組織通過手術取出后置于滅菌后的離心管中儲存在-80 ℃條件下備用。

1.2.2 樣品RNA提取 液氮條件下在研缽中研磨腫瘤組織充分后加入適量Trizol，繼續研磨至液體狀態后轉移至滅菌的離心管中，渦旋30 s后，靜置5 min，在4 ℃、12 000 g條件下離心10 min后取上清液1 mL至滅菌的離心管中。向管中加入200 μL的氯仿，渦旋30 s后，靜置3 min，在4 ℃、12 000 g條件下離心10 min后取上層水相轉至滅菌的離心管中。向管中加入等體積的異丙醇，渦旋15 s后，靜置10 min，在4 ℃、12 000 g條件下離心10 min后除去上清液，隨后用體積分數75%乙醇洗滌RNA沉淀，4 ℃、7 500 g條件下離心5 min后風干液體殘留，加入適量(30 μL)的焦碳酸二乙酯處理水。通過NanoDrop分光光度計和生物分析儀評估RNA濃度和完整性。血液樣品解凍后按照上述步驟提取RNA，并檢測RNA濃度和評估RNA完整性。

1.2.3 qRT-PCR檢測lncRNA表達水平 將提取后的RNA采用日本Takara公司的PrimeScript RT Master Mix進行逆轉錄生成互補脫氧核糖核酸。lncRNA GAS8-AS1的相對表達分析通過熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcript polymerase chain reaction，qRT-PCR)實現，按照日本Takara公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進行操作,并使用Bio-rad CFX96 qPCR系統進行擴增。使用2-ΔΔCT方法分析lncRNA GAS8-AS1相對表達水平，qRT-PCR實驗至少重復3次。此外，qRT-PCR中涉及的引物由生工生物進行設計并合成，引物序列如下：lncRNA GAS8-AS1-F: CAACGAGCAAACAAGAAGGAG; lncRNA GAS8-AS1-R: TGAGCCAAACAGACCAGTCA;內參基因β-actin-F: GTGGCCGAGGACTTTGATTG; 內參基因β-actin-R: CCTGTAACAACGCATCTCATATT。

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌患者的臨床病理資料81例患者中，男27例，女54例，年齡21～68歲。所有患者均采用細針穿刺活檢確診為甲狀腺乳頭狀癌，其中58例患者腫瘤位于甲狀腺腺體的右葉，6例患者腫瘤位于甲狀腺的雙側腺葉，17例患者腫瘤位于甲狀腺腺體的左葉。81例患者在術前進行甲狀腺功能檢測顯示功能均正常。81例患者在術前進行B超檢查，結果顯示，75例患者甲狀腺結節數目為1個，6例患者甲狀腺結節數目為2個(腫瘤分別位于甲狀腺的雙側腺葉)。81例患者的治療方式均為單純手術切除。術后隨訪調查顯示患者恢復良好。

2.2 lncRNA GAS8-AS1在試驗組和對照組血液及試驗組腫瘤組織中的表達水平術前，試驗組患者血液中lncRNA GAS8-AS1相對表達量較對照組明顯減少(P<0.05)。術前，試驗組患者腫瘤組織中lncRNA GAS8-AS1相對表達量與其血液中的相對表達量相近(P>0.05)，且較對照組血液中的相對表達量明顯降低(P<0.05)。術后1 a，試驗組患者血液中lncRNA GAS8-AS1的相對表達量較術前明顯升高(P<0.05)，且與對照組血液中的相對表達量相近(P>0.05)。見圖1。

圖1 lncRNA GAS8-AS1在試驗組和對照組血液及試驗組腫瘤組織中的表達水平

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是一種常見的甲狀腺疾病，其發病年齡范圍廣[6]。盡管絕大多數患者在手術切除治療后預后良好，但是仍然有極少數會復發。傳統診斷方法是通過超聲引導下細針穿刺活檢，對于甲狀腺結節較大的患者而言，這種方式具有很高的準確性，但是對于甲狀腺結節<5 mm的患者其準確性大幅下降，因此，如何快速高效診斷甲狀腺乳頭狀癌具有重要的臨床意義[7-8]。lncRNA在腫瘤生物學中具有十分關鍵的作用，并且在腫瘤診斷和預后方面可以作為一類新型的生物標志物。甲狀腺乳頭狀癌中已經鑒定出多種表達異常的lncRNA，其可能影響和誘導腫瘤發生。Lan等[9]鑒定出lncRNA NONHSAT037832在甲狀腺乳頭狀癌中的功能和臨床意義。Qin等[10]觀察MIR22HG在甲狀腺癌中的表達情況及其與預后的關系，結果表明MIR22HG可以作為甲狀腺癌的新型生物標志物。

LncRNA GAS8-AS1是近期鑒定出的一種lncRNA，在甲狀腺乳頭狀癌患者體內表達異常。相關證據顯示，甲狀腺乳頭狀癌患者中lncRNA GAS8-AS1表達水平相對于正常組織而言顯著降低[11]。此外，患者血液中的lncRNA GAS8-AS1表達水平也明顯處于抑制狀態[5]。這提示lncRNA GAS8-AS1可以作為一種新型的生物標志物用于臨床上甲狀腺乳頭狀癌的診斷。本研究根據臨床病例證實，甲狀腺乳頭狀癌患者的血液和腫瘤組織中lncRNA GAS8-AS1明顯低于對照組，而且，術后患者血液中lncRNA GAS8-AS1明顯回升，這進一步證實了lncRNA GAS8-AS1對于甲狀腺乳頭狀癌的診斷和術后監測具有重要作用。當然，lncRNA GAS8-AS1在甲狀腺乳頭狀癌發生、發展、遷移等生物過程中的具體作用機制需要后續更多的實驗來證明。

綜上所述，檢測lncRNA GAS8-AS1在甲狀腺乳頭狀癌術前和術后的表達水平有助于進一步推斷lncRNA GAS8-AS1作為生物標志物用于鑒定甲狀腺乳頭狀癌的可行性，為lncRNA用于甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷和術后監測提供了堅實的理論依據。