關節滑膜炎性微環境對類風濕關節炎發生發展作用的研究進展

王 言，吳 虹，鄧 然，戴學靜，占 翔

(安徽中醫藥大學藥學院，新安醫學教育部重點實驗室，中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種常見的、以慢性滑膜炎癥為特征的自身免疫性疾病，其病理特征表現為滑膜組織異常炎性增生、血管新生、血管翳形成、關節軟骨和骨的不可逆性破壞，甚至引發畸形病變以及嚴重的并發癥[1]。目前為止，全世界約有1%-2%的人口深受RA疾病的困擾，嚴重影響人們的健康與生活質量。然而，RA致病機制尚未完全明確，但是已經有研究表明關節滑膜微環境與RA的發病過程緊密相關。近年來，大量研究表明血管翳的形成可能是RA的潛在發病機制，此特點同惡性腫瘤中血管增生極為相似。RA患者關節滑膜微環境中常常顯示關節腔缺氧和眾多炎性因子浸潤等[2]。因此，全面闡明RA與關節滑膜炎性微環境之間的具體聯系有助于拓展對RA更加深入的認識。

1 RA炎性微環境

Schofield在1978年第一次提出了“微環境”的概念，其主要是由各種細胞、細胞外部基質營養成分和生長因子等因素共同構成的一種動態生長環境，有利于細胞的正常存活[3]。在生理狀態下，微環境對滑膜細胞起保護作用；在病理狀態下，微環境發送各種應激信號，引起關節滑膜周圍細胞的各種應激反應。炎癥反應是機體組織受損時最常見的應激反應，也是RA的主要病理表現之一。巨噬細胞、成纖維樣滑膜細胞(fibroblast synoviocytes，FLS)以及血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)等共同組成了RA關節滑膜炎性微環境的細胞成員。這些細胞相互影響，相互作用，通過機體產生大量的基質細胞衍生因子、促炎細胞因子、促血管生成細胞因子以及其他多種介質進入關節腔，從而介導RA的病變過程。

2 巨噬細胞

巨噬細胞是一類具有吞噬作用的免疫細胞，其通過分泌基質細胞衍生因子和促炎細胞因子而發揮機體免疫調節作用和介導炎癥反應。人體單核細胞作為巨噬細胞主要的來源者，其經過機體血液循環系統而廣泛分布于全身組織，并逐漸分化形成巨噬細胞。滑膜組織巨噬細胞是健康滑膜組織的常駐細胞，其細胞不同的表現形式和RA具有相關聯系。近來發現，單核細胞衍生的巨噬細胞在慢性疾病模型中占主導地位并驅動炎癥，這些巨噬細胞可能決定著慢性疾病或者炎癥的發生以及消退[4]。

2.1 RA發病機制與巨噬細胞極化相關在復雜的細胞微環境中，巨噬細胞根據外界所受刺激產生迅速的反應，活化成不同的形態，該過程稱為極化。正常滑膜組織巨噬細胞可被關節滑膜炎性微環境中某些細胞因子所極化，極化的巨噬細胞主要包括兩種亞型：經典活化型巨噬細胞(classically activated macrophages，CAMs or M1)和替代性活化型巨噬細胞(alternatively activated macrophages，AAMs or M2)。M1擁有很強的自我促炎免疫能力以及抗原呈遞能力，對促進機體刺激物的清除和自我免疫功能的調節具有關鍵作用。M1型巨噬細胞在炎性介質的刺激作用下，使適應性免疫系統傾向于Th1反應；M2型巨噬細胞可能參與炎癥的解決，使免疫傾向于Th2反應。這兩種功能迥異甚至拮抗的不同極化類型的巨噬細胞分別反映著Th1/Th2免疫應答(Fig 1)。在RA疾病相關研究中已有結果顯示，M1/M2比值升高可以打破關節滑膜微環境中的炎性動態平衡[5]。因此，針對M1/M2不平衡的比例，探尋更多的方法將M1型巨噬細胞重新極化成M2型巨噬細胞，可能會成為RA有效的治療策略。

2.2 信號途徑與巨噬細胞的極化相關

2.2.1Notch途徑 Notch途徑在RA以及其他自身免性疫疾病中扮演一個重要的角色。DAPT作為Notch的抑制劑，能有效的改善RA關節損傷。Notch信號在巨噬細胞中也發揮了重要的促炎作用，如LPS信號刺激活化的巨噬細胞，在炎癥狀態下伴有Notch信號活化和巨噬細胞極化以及炎癥因子產生的現象。Sun[6]發現，滑膜巨噬細胞在炎性微環境下變得異常活躍并且伴有Notch途徑的激活和趨向M1型極化的現象。接著也有研究發現，Notch和TLR4信號途徑存在交叉串擾，Notch能夠有效提高IRF8蛋白的表達，通過激活TLR4途徑增強Notch信號轉導[7](Fig 2)。當Notch1信號被激活時，能明顯促進巨噬細胞在炎癥反應中相關炎癥介質的釋放。因此，以早期激活Notch信號的M1型巨噬細胞為治療對象，可能會逐漸成為治療RA和其他多種炎癥疾病的一種新的治療方法和策略。

Fig 1 Role of macrophages in RA

Macrophages derived from synovium of the joint are polarized toward M1 and M2 under the stimulation of different signals in the microenvironment. Polarized macrophages secrete different cytokines and chemokines, which regulate the balance of Th1/Th2 immunity and induce other cells to participate in inflammatory response.

Fig 2 Function of Notch pathway

Activation of Notch signaling promotes RA development. DAPT acts as an inhibitor of Notch, which blocks the Notch pathway and relieves RA symptoms. NICD regulates the expression of Notch target genes(Hes, Hey) by linking to the RBP-J protein. Meanwhile, RBP-J can activate TLR4 pathway by up-regulating IRF8, increase the number of M1, and promote the development of inflammation.

2.2.2MAPKs途徑 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過外部信號激活并誘導下游炎癥基因的轉錄表達[8]。MAPKs家族成員主要有ERK、p38、JNK，并且在RA和其他炎癥疾病中高度表達。MAPKs通過自身磷酸化水平進行活性調節，同時伴有相關轉錄因子(NF-κB)的激活，發揮促炎作用。Tian[9]等人發現，CXCR4在急性肺損傷ALI模型小鼠巨噬細胞中呈現高度表達狀態，可能具有調控巨噬細胞的功能，使用siRNA干擾RAW 264.7中CXCR4表達，發現MAPKs和NF-κB通路中關鍵蛋白的磷酸化水平被顯著降低，同時也降低了巨噬細胞相關炎性介質(IL-6和TNF-α)的釋放，緩解了炎癥損傷。Zhao[10]等人發現，IL-4對氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)所誘導p-ERK和p-JNK的表達以及CD86/CD206(M1/M2)的比值均具有顯著的下調作用，提示IL-4對于MAPKs途徑的抑制作用與M2巨噬細胞的極化相關。目前還有新的研究顯示，JNK信號通路在調節脂肪性肥胖引起的炎癥反應和巨噬細胞極化以及代謝功能障礙的發展過程中均具有重要調控作用。因此，進一步全面了解MAPKs途徑與巨噬細胞極化之間的聯系，對于早期炎癥的控制具有重要作用。

2.2.3JAK/STAT途徑 JAK-STAT通路是一類由細胞因子所刺激激活的信號途徑，廣泛參與機體的各種生理病理過程，尤其在炎癥反應中具有重要作用[11]。JAK-STAT途徑具有多種信號因子的靶點，主要有IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-23和GM-SCF等，這些細胞因子被認為在RA炎癥反應中具有重要的生物學作用。例如，IL-6可以通過JAK-1、JAK-2、TYK-2激酶激活JAK/STAT途徑，其主要是通過影響STAT1和STAT3蛋白表達，發揮基因調控作用[12]。同時有研究表明，JAK/STAT信號轉導途徑的激活與巨噬細胞的極化過程具有密切關聯。IFN-γ作為巨噬細胞最強的免疫激活劑之一，其主要負責激活STAT1，從而有效增強機體免疫調節作用和介導炎癥反應以及M1型極化。IL-4作為典型的抗炎細胞因子，其通過與IL-4Rα結合，激活JAK/STAT6途徑，從而促進M2型巨噬細胞極化[13]。不同JAK/STAT途徑的激活對巨噬細胞的極化具有不同的調控作用，全面深入了解JAK/STAT途徑與RA巨噬細胞極化之間的具體聯系，可為RA新的藥物研制提供有力的理論支撐。

3 FLS

滑膜細胞是一類具有基質重塑作用的關節腔常駐細胞，其通過異常活化介導關節破壞和炎癥反應。FLS作為滑膜細胞的主要亞型，是滑液和滑膜基質中關鍵成分的主要制造者，在維持正常關節平衡中具有重要作用。近來發現，異常激活的FLS在RA中占據主導地位并驅動炎癥發生，其可能決定疾病的進程。

3.1 RA發病機制與FLS異常增殖相關滑膜組織異常炎性增生主要是由FLS和巨噬細胞所驅動的結果。FLS作為關節滑膜間充質細胞以及效應細胞，在RA發病中具有重要作用。FLS具有類癌細胞的生長特性，在RA病理狀態下FLS可以被促炎因子和其他炎性信號所刺激激活，呈現出細胞增殖異常和凋亡能力不足，同時還伴有大量、多種促炎介質的釋放。產生的促炎介質又可以直接或間接作用于FLS自身使其持續活化，兩者不間斷反復循環，促使滑膜組織異常增生，關節腔出現缺氧現象，加重滑膜炎癥不良反應。因此，深入了解FLS增殖異常和凋亡不足的具體機制，可為RA治療提供新的思路。

3.2 信號途徑與FLS的異常增殖相關

3.2.1Wnt/β-catenin途徑 Wnt途徑廣泛參與人體細胞的增殖和分化過程，嚴重影響機體的多種生理和病理。盡管Wnt途徑在RA中研究相對較晚，但是已經有很多證據表明該通路可以通過多種方式廣泛作用于RA，并在RA的發生及發展演變過程中發揮主導作用。根據激活方式的不同，Wnt通路主要被劃分為4條:① Wnt/β-catenin；② Wnt/c-JNK；③ Wnt/Ca2+；④ Wnt/PCP。目前研究最多、最全面的Wnt途徑是Wnt/β-catenin，其主要通過一種細胞因子(Wnt配體)與受體配對結合，形成二聚體形式而得到激活，并通過β-catenin與轉錄因子形成復合物調控下游基因的表達。

Wnt/β-catenin途徑在RA發病的過程中具有雙重作用，一方面可以通過調控FLS的異常增殖、影響TNF-α和IL-1等炎性因子的分泌；另一方面也可以調控骨代謝/骨破壞等途徑，對骨的形成具有促進作用[14]。有研究表明，Wnt1、Wnt5a、Wnt7在FLS異常增殖的過程中均有較高的表達，通過下調這些配體的表達可以顯著抑制FLS的異常增殖。Wnt10在FLS和VEC中均有較高的表達，且與炎性細胞的浸潤程度具有相關聯系(Fig 3)。Wnt1配體通過激活Wnt/β-catenin途徑來調控纖維連接蛋白和基質金屬蛋白酶3的生成，從而促進FLS的生存和黏附能力，誘導RA炎癥的發生。Wnt3主要在骨形成方面具有重要促進作用，其主要是通過激活經典Wnt途徑從而打破成骨細胞和破骨細胞的形成平衡。FLS產生Wnt5a配體，其通過與Frz5結合形成復合物直接或間接作用于FLS自身，導致PKC途徑激活，有效加劇RA炎癥反應。Wnt7b在RAFLS中被發現存在異常表達，通過體外研究實驗發現上調FLS中Wnt7b的表達能夠有效促進炎性因子產生，加重RA癥狀[15]。鑒于Wnt基因在滑膜炎癥和成骨細胞分化方面存在不同的作用，只有尋找或者

Fig 3 Function of Wnt pathway

Wnt signaling plays a dual role in the pathogenesis of RA. The different ligands of Wnt signaling activate Wnt pathway by binding to the receptor, increase the expression of β-catenin in cytoplasm, and regulate the expression of Wnt target genes(MMP7, c-Myc, c-Jun). The activation of Wnt signal promotes abnormal synovial proliferation and inflammatory factor secretion, and regulates bone metabolism/bone destruction, which can promote bone formation.

設計對FLS異常增殖具有選擇性抑制而不影響成骨細胞分化的藥物，對RA的治療才能起到更加顯著的效果。

3.2.2P13K/AKT途徑 3-磷酸肌醇激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)途徑是目前被認為與細胞凋亡最相關的信號途徑之一，其在RA滑膜組織中被發現異常表達，可能對FLS增殖和凋亡的失衡具有重要主導作用。有研究表明，PI3K/AKT途徑與RA的發生及其發展過程具有密切關聯。TNF-α作為該通路的正向激活調控因子，其通過刺激激活該途徑，進一步降低Bax/Bcl-2的比值，抑制FLS凋亡反應。同時也有研究顯示，通過PI3K/AKT/mTOR途徑可以抑制FLS自噬，從而促進FLS存活，加重RA炎癥反應[16]。胰島素生長因子1受體(insulin like growth factor 1 receptor, IGF-1R)作為該途徑的另外一個正向調控因子，其具有促進細胞生長和增殖的作用。Chen[17]等人闡明了RA患者FLS中IGF-IR/PI3K/AKT/m-TOR信號通路的異常活化對于FLS異常增殖的可能具體機制，并通過下調IGF-1的表達水平，抑制該通路的活化，結果發現FLS的G2/M細胞周期受到阻滯，導致FLS增殖受到抑制。到目前為止，對于PI3K/AKT途徑與FLS異常增殖的機制仍然需要進一步深入全面了解，從而為RA的治療提供新的理論基礎。

4 VEC

內皮細胞也稱VEC，是一類覆蓋血管內膜表面的連續單層扁平或多角形的細胞，其通過異常增殖和遷移介導血管新生。作為血管壁與血液之間的分界細胞，是新生血管形成的形態基礎，在維持血管的功能中發揮重要作用。近來發現，VEC既是感應細胞又是效應細胞，其不僅能感知血液中的炎性信號、激素水平和壓力等信息，而且能通過分泌多種血管活性物質對這些信息做出反應。

4.1 RA發病機制與VEC增殖和遷移相關血管新生是目前治療RA的主要假說機制之一，其既是引起血-關節腔屏障的間質通透性加大的原因，又是RA血管翳產生和維持的重要標志[18]。在RA中，關節滑膜處存在著大量微血管的新生。VEC作為血管結構的主要構成細胞，其增殖和遷移功能的改變對于新血管的形成都具有重要調控作用。就RA來說，血管新生是由促進血管新生和抑制血管新生兩類不同的介質共同調控的過程。因此，進一步了解血管新生的調控機制，干預VEC，抑制RA血管新生是治療RA新的方向。

4.2 信號途徑與VEC增殖和遷移相關

4.2.1VEGF/VEGFR-2途徑 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)與其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)組成的信號途徑被普遍認為是RA血管新生的中央調控系統。VEGF對RA血管新生具有顯著的刺激作用，其表達含量可被用來衡量疾病的嚴重程度。而主要表達在VEC細胞膜上的VEGFR-2則被認為是促進細胞增殖、遷移、血管新生以及改變血管滲透性的關鍵媒介。VEGF/VEGFR-2是一條對機體血管新生整個過程都具有正向調控作用的途徑，其特點可以通過串聯反應過程活化下游所介導的其他信號途徑(p38、ERK、PI3K/AKT)從而誘導VEC增殖、遷移，調控機體血管新生[19]。目前也有研究表明，VEGF/VEGFR-2途徑和Dll4/Notch途徑在RA血管新生過程中存在一定的相關聯系(Fig 4)。VEC在低氧的環境下容易受到VEGF的強烈刺激，一方面通過激活VEGFR-2受體可以促進血管生成；另一方面VEGF也可以通過調控Notch配體Dll4的信號表達，激活Dll4/Notch信號轉導通路從而減弱血管生成。從而揭示了VEGF對Dll4具有正向調控作用，而Dll4對VEGF具有負向調節作用[20]。因此，RA滑膜血管新生并不是一個簡單的過程，而是在VEGF/VEGFR-2和Dll4/Notch以及其它相關信號途徑之間相互協調共同完成的過程。

Fig 4 Correlation between VEGF/VEGFR-2 and Dll/Notch pathways

VEGF has a significant stimulating effect on RA angiogenesis. Activation of the VEGF/VEGFR-2 pathway stimulates downstream signaling pathways(p38, ERK, PI3K/AKT) to promote VEC proliferation, migration, and regulate angiogenesis. However, VEGF also has a positive regulatory effect on Dll4. The activation of Dll/Notch pathway can inhibit the proliferation and migration of VEC. Finally, the VEGF/VEGFR-2 and Dll/Notch pathways interact with each other to regulate RA angiogenesis.

4.2.2Ang/Tie2途徑 血管生成素(angiopoietin，Ang)和酪氨酸激酶受體2(angiopoietin-tyrosine kinase receptor 2，Tie2)組成的途徑對毛細血管的成熟和維持功能的穩定具有重要作用[21]。目前了解較多的是Ang1和Ang2，Ang1主要是由周細胞產生，其通過旁分泌的方式傳遞并作用于VEC胞膜上的Tie2，促進連接蛋白的連接，降低血管通透性；而Ang2是由VEC分泌產生，其通過與Ang1競爭性結合到Tie2，促進連接蛋白連接的解離，提高局部血管的通透性并促進血管新生[22]。同時也有研究顯示，在缺氧狀態下VEGF與Ang2存在緊密聯系。當VEGF存在時，Ang2可以促進VEC的增殖和遷移，從而促進血管的新生；當VEGF表達受到抑制時，Ang2可以引起VEC的死亡，以及血管退化。因此，深入了解HIF-VEGF-Ang信號軸參與RA血管新生的調控機制，對于RA疾病的防治具有重要的作用。

5 炎癥細胞因子

關節滑膜炎性浸潤是RA疾病的主要特征表現之一，其主要是由微環境中細胞因子信號網絡紊亂所造成的結果，對巨噬細胞的極化、FLS的異常增殖、VEC的血管新生等過程都具有重要影響作用。RA中較典型的炎癥因子主要有：TNF-α、IL-6、VEGF、GM-CSF等。TNF-α主要來源于滑膜巨噬細胞和FLS，其通過與TNFR1結合直接激活下游的MAPK和NF-κB信號轉導通路，促進眾多炎癥介質的釋放，開啟一系列的促炎反應[23]。IL-6也是巨噬細胞和FLS的產物之一，其通過與sIL-6R形成復合物介導下游信號通路(MAPK、JAK/STAT3、RANKL/NF-κB)的激活，誘導滑膜細胞異常增殖以及促進VEC分泌VEGF和MMP，激活微血管新生[24]。而由巨噬細胞和FLS產生的另一細胞因子VEGF主要受到缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α) 的調控，其組成的HIF-VEGF-Ang信號軸對RA滑膜血管新生具有重要調控作用。眾多細胞在多種促炎細胞因子的刺激下均可以表達GM-CSF，而過表達的GM-CSF也可以激活其下游介導的JAK/STAT/SOCS、MAPK、PI3K以及其他的信號途徑，參與調控RA炎癥反應[25]。關節滑膜微環境中的這些炎癥細胞因子相互交錯、相互聯系，共同刺激加速了RA的產生以及發展。

6 結語

關節滑膜炎性微環境同腫瘤炎性微環境相似，是一個由多種細胞以及生長因子組成的復雜整體，它們共同調控著RA疾病的發生發展過程。微環境中某些炎性細胞因子能夠直接刺激激活巨噬細胞的極化，極化后的細胞又間接促進特定炎性因子的釋放，進一步加重機體炎癥免疫反應。FLS具有類腫瘤樣生長特性，使滑膜正常組織過度增生肥大，耗氧量增加而滑膜組織產生急性缺血缺氧現象，導致滑膜微血管過度生成，新生的微血管又可以為滑膜組織的生長提供大量營養物質，在FLS異常增殖和VEC的血管新生協同作用下共同促進RA特征性的血管翳的形成。因此，RA關節滑膜炎性微環境影響著RA疾病的發生發展各個階段，重視RA關節滑膜炎性微環境的研究有助于拓展對RA疾病更加全面的認識并為探索RA的治療提供參考。