BML-111抑制Hep3B細胞遷移及機制初探

徐 芬， 郝 華， 吳德強，汪慶余，李里香，徐 靜，林 蘭，馮 雨

(南昌大學第二附屬醫院 1.全科醫學科、2. 病理科、3. 藥劑科，江西 南昌 330006)

肝癌是消化系統常見惡性腫瘤，其發病與慢性肝炎病毒(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)密切相關。如何抑制肝癌組織中的炎癥反應成為肝癌治療的重要策略。脂氧素是人體內最重要的炎癥自穩物質，在免疫自穩(包括炎癥[1-2]及腫瘤[3-4])中扮演著重要角色，然而其半衰期極短且容易降解，不適合進行在體實驗研究。而BML-111是其類似物，在結構上與脂氧素類似，而且兩者的受體相同(均為甲酰肽受體2，FPR2)，保留了脂氧素功能所必需的基團，且不易降解，性質穩定，因而在實驗研究中應用較廣，研究發現其對炎癥[5-6]及妊高癥[7]具有明顯的抑制作用。我們課題組研究發現，脂氧素及BML-111調控ILK軸抑制肝細胞癌EMT及轉移[8]。而近年來研究發現，5-脂加氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)在多種癌組織中高表達并參與腫瘤的演進。本研究擬以人肝癌細胞細胞系(Hep3B)為實驗對象，采用BML-111及Boc-2(FPR2阻斷劑)干預Hep3B細胞，觀察BML-111對Hep3B細胞遷移的作用及對5-LOX的調控作用，為抗肝癌研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑TRIzol(Invitrogen15596018)；引物設計及合成(上海賽百盛)；逆轉錄相關試劑、PCR擴增儀(美國MJ research ABI9600)；兔抗5-LOX(Santa Cruz Biotechnology，sc-20785)；FITC熒光二抗(Boster，SA-1068)；Boc-2(Sigma，06731)；RPMI 1640(Gibco，31870074)；BML-111(Cayman，10005032)；血清(杭州四季青，2104)。

1.2 細胞培養與實驗分組實驗用Hep3B購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，置于培養箱培養。培養液中含20%胎牛血清(FCS)及雙抗(青霉素和鏈霉素)。使用胰酶消化傳代。采用第3～5 代細胞進行實驗。實驗分為三組：(1)空白組；(2)BML-111組；(3)BML-111 +Boc-2 組(Boc-2預處理30 min后，最后加入BML-111)。參考以往的文獻，BML-111 選擇濃度為200 μg·L-1[9]。

1.3 免疫熒光實驗24孔板接種細胞，給藥，24 h后棄上清，用PBS洗板，冰甲醇固定，Triton破膜，BSA封閉，40 min后加入5-LOX一抗孵育4 h(4 ℃)后PBS 洗，二抗(熒光)孵育l h(室溫)，Hoechest染核，15 min后顯微鏡下觀察，拍照。熒光強度為5-LOX的表達水平，分析采用ImageJ軟件。

1.4 RT-PCR技術檢測MMP-2和MMP-9表達TRIzol法提取RNA。逆轉錄具體過程如下：先測定RNA的濃度，將上樣的總RNA 量定為4 μg，根據濃度計算出需要上樣的體積V，而后加入OligodT 1 μL，用DEPC補足，總體積定為16 μL。短暫離心后，接著70 ℃水浴約5min，迅速置于冰上至少1 min。接著加入其它成分(包括5×buffer 5 μL，dNTPmix 3 μL，M-MLV1 μL)，最后總體積為25 μL，離心后42 ℃水浴(60 min)，然后85 ℃水浴(7 min) ，從而得到cDNA 樣本。PCR 過程：反應體系總體積為25 μL，包括有12.5 μL PCR 混合液，加入上、下游引物各1 μL，cDNA的上樣量為1.5 μL ，最后體積定為25 μL(用無菌水補足)。內參為GAPDH。反應條件及引物序列見Tab 1。經擴增、電泳、成像，最后半定量分析，每個樣本均重復3次實驗，以目的基因與內參之比作為其相對表達量。

1.5 Transwell實驗(1)細胞的準備：上室加入細胞懸液200 μL，加藥。下室中，加入600～700 μL培養基，孵箱中培養，時間為24 h。(2)細胞計數：取出培養板，棄培養液，PBS 洗2次。再加入冰甲醇固定細胞(10 min)，用棉簽擦去上室中未遷移的細胞，然后用蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗，在顯微鏡下拍照(隨機選取視野)并計數。顯微鏡下計數細胞，統計學分析。

1.6 HE染色將細胞接種于六孔板中，加藥作用24 h后，棄去上清，固定，染色。

2 結果

2.1 BML-111對Hep3B細胞形態的影響Fig 1A所示，Hep3B細胞在未加任何刺激物的情況下，細胞呈多角形，多突起，細胞排列松散，體現了間質細胞的特點，即發生了上皮-間質轉化(EMT)。而加入BML-111后，細胞排列緊密，突起明顯減少，體現了上皮細胞的特點。而先加入受體阻斷劑Boc-2后，BML-111并不能使其恢復上皮細胞形態，說明BML-111需要與受體結合發揮抑制EMT作用。

2.2 BML-111對Hep3B細胞遷移的影響Fig 1B1及B2所示，在Transwell遷移實驗中，3組穿膜細胞數分別為44.666 7±11.238 91、18.666 7±5.507 57和44.333 3±11.930 35。空白組Hep3B穿膜細胞的數目較多，而加入BML-111后，細胞數減少顯著(P=0.019)，說明細胞遷移作用能被BML-111抑制。BML-111作用能被Boc-2阻斷(P=0.020)。

Fig 1 Effect of BML-111 on Hep3B cell morphology and

*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsBML-111 group

2.3 BML-111對Hep3B 5-LOX表達及細胞定位的影響Fig 2A，B所示，在免疫熒光實驗中，空白組Hep3B 5-LOX主要定位于細胞質和細胞核，加入BML-111后，5-LOX表達明顯減少(P=0.000)，并且主要定位于細胞質。而用Boc-2預處理后，再加入BML-111，并不能抑制5-LOX的表達(P=0.000)。

Tab 1 List of oligonucleotides used as PCR primers and reaction conditions

Fig 2 Effect of BML-111 on Hep3B 5-LOX expression and cell location (Bar=20

*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs BML-111 group

2.4 BML-111下調5-LOX進而抑制MMP-2、MMP-9 mRNA表達如Fig 3A1及A2所示，在Western blot實驗中，空白組、BML-111組及BML-111+Boc-2組5-LOX的蛋白表達量(以與內參的灰度值比較)分別為1.563 7±0.116 29、0.443 3±0.110 60和1.616 7±0.137 96。在BML-111的作用下，5-LOX的蛋白表達量明顯減少，與空白組比較，差異有顯著性(P=0.000)。而用Boc-2預處理可阻斷其作用，5-LOX并不減少(P=0.000)。如Fig 3B1，B2，B3所示，在RT-PCR實驗中，空白組MMP-2、MMP-9的表達量分別為0.543 3±0.070 95和0.793 3±0.045 09，加入BML-111后，兩者的表達量明顯減少，分別為0.110 0±0.030 00和0.396 7±0.047 26，與空白組比，差異均有顯著性(P值均為0.000)。而加入Boc-2預處理后，再加入BML-111，兩者的表達量分別為0.556 7±0.109 70和0.813 3±0.075 06，與BML-111組比，差異均有顯著性(P值均為0.000)。

3 討論

肝癌是國內常見的惡性上皮性腫瘤，其主要特征是生長迅速，早期發現困難，發現時往往為晚期，患者預后極差。如何抑制腫瘤轉移是當前腫瘤研究的熱點。腫瘤細胞由原發部位首先發生EMT轉變，進而發生遷移、累及并侵犯周圍組織，侵入脈管(包括血管和淋巴管)，轉移至遠隔臟器。而眾所周知，肝癌與慢性肝炎、肝硬化(乙肝、丙肝所致)關系密切。持續的慢性炎癥所致肝細胞的增生是肝癌發生的主要原因，因而，如何抑制肝癌組織內的慢性炎癥是抑制肝癌的治療靶點。

脂氧素由花生四烯酸合成，是體內最重要的免疫自穩物質，對炎癥的消退及抗腫瘤方面都發揮著重要的功能，是體內調控免疫自穩的重要物質。我們課題組近年來研究發現，脂氧素及其類似物對肝損傷[5]及肝癌[8]均具有調控作用。但由于脂氧素的半衰期短，性質不穩定，不適合實驗動物研究。而脂氧素類似物BML-111在結構上具有與脂氧素相同的功能基團，而性質又相對穩定，因此被廣泛應用于實驗研究。5-LOX是脂氧素合成過程中的最重要的酶類，并且參與了腫瘤演進過程。有研究證明，5-LOX在多種惡性腫瘤中高表達，并且調控了腫瘤演進的多個過程，研究5-LOX的抑制劑成為抗腫瘤研究的熱點[10-14]。侵襲和遷移是惡性腫瘤的重要特征，與腫瘤的進展與預后密切相關。而我們的研究發現，BML-111能有效抑制肝癌細胞EMT和遷移，BML-111在蛋白水平能明顯抑制5-LOX的表達，并且通過其受體發揮作用。MMP-2和MMP-9與腫瘤遷移密切相關，所以我們進一步在mRNA水平研究了BML-111是否能抑制MMP-2和MMP-9的表達，結果與我們預期的一致。

Fig 3 MMP-2 and MMP-9 mRNA expression inhibited by BML-111 via down-regulating 5-LOX

*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsBML-111 group

綜上所述，BML-111的抗肝癌作用可能是調控多通路、多靶分子的功能。我們的研究為其抗腫瘤研究提供了新的思路，5-LOX可作為腫瘤治療的靶點，BML-111抗肝癌機制非常復雜，尚需進一步深入并多方面研究。

(本實驗是在南昌樂悠生物有限公司實驗平臺完成，感謝何遠橋老師及其團隊所給予的支持和幫助)