芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯通過調節JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路抑制人外周血Th17細胞的分化

朱 悅，湯小雨，蔡小雨，王 琛，張賢政，韓 樂，張玲玲，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點實驗室、安徽省高校抗炎免疫藥物協同創新中心，安徽 合肥 230032)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)以慢性滑膜炎及關節、軟骨和骨組織的破壞為特征，可導致全身性炎癥和自身抗體的產生，它是一種全身性自身免疫性疾病。T細胞亞群的失衡與T細胞的異常活化是RA發生、發展的關鍵因素之一，其中Th17細胞作為輔助性T細胞(helper T cell，Th)的新亞型之一，在自身免疫病中占據重要地位。JAK是一種新型RA藥物作用靶點，JAK/STAT信號通路參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節過程，具有強效抗炎作用[1]。JAK/STAT信號通路的激活能夠促進轉錄因子維A酸相關孤獨受體γ-t(retinoic acid-related orphan nuclear hormone receptor γ-t，RORγ-t)的表達。RORγ-t是Th17細胞的特異轉錄因子，它的激活可以促進Th17細胞的分化及細胞因子IL-17A的分泌，參與炎癥進程[2,3]。白芍總苷于1998年在中國被批準用于治療RA，具有抗炎和免疫調節作用。芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)是對白芍總苷的主要有效成分芍藥苷進行化學結構修飾得到的活性單體。實驗室前期研究發現，CP-25可能通過調控T細胞亞群分化和活化對膠原性關節炎[4]、佐劑性關節炎[5]和干燥綜合征[6]動物模型發揮治療作用，但是否通過JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路調控T細胞分化，目前尚不清楚。本實驗以JAK/STAT3及下游信號通路的活化為切入點，研究CP-25對人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路的調節及Th17細胞分化的影響。

1 材料

1.1 樣本從健康人外周血(取自安徽醫科大學第一附屬醫院)中分離的PBMCs。

1.2 藥物與試劑CP-25由安徽醫科大學臨床藥理研究所制藥部門提供，白色粉末，純度大于 98%；Recombinant Human TNF-α 購自novoprotein公司(批號：C008)；細胞刺激混合物(包含佛波酯、離子霉素、布雷菲爾德菌素A)購于美國eBioscience公司(批號：00-4975-03)；艾拉莫德購于江蘇先聲藥業有限公司國家藥品標準H20110084(25 mg·14粒/盒)；托法替布購于美國MCE公司(批號：HY-40354A)；人淋巴細胞分離液購于深圳達科為公司(批號：7111011)；RPMI 1640培養液購于美國Gibco公司(批號：11875093)；四季青特級胎牛血清購于浙江天杭公司(批號：13011-8611)；細胞增殖試劑盒購于天津百螢生物(批號：35001)；PE通道小鼠抗人IL-17A(批號：560438)、 FITC通道小鼠抗人CD4抗體(批號：555346)購自Becton Dickinson公司；STAT3(批號：12640)、p-STAT3(批號：9145)、JAK1(批號：3344)、JAK2(批號：3230)、JAK3(批號：8863)抗體購自Cell Signaling Technology公司；p-JAK1(批號：YP0154)、p-JAK3(批號：YP0756)抗體購自Immunoway公司；p-JAK2(批號：ARG57812)、IL-17A(批號：ARG55256)抗體購自Arigobio公司；RORγ-t抗體購自Novus Biologicals公司(批號：NBP2-24449)；Alexa Fluor 647標記山羊抗兔熒光二抗(批號：FMS-RBaf64701)、Alexa Fluor 647 標記山羊抗小鼠熒光二抗(批號：FMS-Msaf64701)購自南京福麥斯生物技術有限公司；ECL 發光顯色試劑盒購于美國Thermo Pierce試劑公司(批號：NCI4106)。

1.3 儀器Bio Tek Elx×808酶標儀(美國Bio Tek公司)；FC500流式細胞儀(美國Beckman公司)；KDC-40超速離心機(科大創新中佳公司)；ImageQuant LAS 4000熒光及化學發光成像系統(美國GE公司)；BX-50型正置顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 密度梯度離心法分離人PBMCs在無菌離心管中加入一定體積的人淋巴細胞分離液，用無菌PBS按照1 ∶ 1稀釋新鮮人抗凝全血。將稀釋后的血樣小心加到分離液上方后3 000 r·min-1離心30 min。用無菌巴氏吸管將血漿層與分離液層間單個核細胞層吸出，加入無菌PBS洗滌兩遍，離心棄上清，用含有10% FBS的RPMI 1640將底部離心下來的細胞重懸備用，得到的細胞懸液即為人PBMCs。

2.2 CCK-8法檢測CP-25對人PBMCs增殖功能的影響將2.1分離出的人PBMCs懸液計數，調整細胞密度為1×109·L-1。在96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液，加入TNF-α(10 μg·L-1)與細胞刺激混合物(2 mL·L-1)聯合刺激。按照空白對照組、刺激組、CP-25組(10 μmol·L-1)、艾拉莫德組(80 μmol·L-1)、托法替布組(10 μmol·L-1)，每組設5個復孔，置于5% CO2，37 ℃培養箱中培養24 h后，加入10 μL CCK-8試劑，用錫箔紙包好培養板避光，置于5% CO2，37 ℃培養箱中避光培養30 min、1 h、2 h和3 h后，用酶標儀檢測A450 nm值，選取合適時間點進行數據統計分析。

2.3 流式細胞術檢測STAT3、p-STAT3、RORγ-t和IL-17A在人PBMCs中Th細胞的表達將人PBMCs細胞懸液鋪于24孔板中，每組4個孔，每孔5×106個細胞，按照空白對照組、細胞刺激劑刺激組、CP-25組、艾拉莫德組、托法替布組進行刺激加藥處理，培養24 h后將培養板中的每孔細胞吸取轉移至ep管中，用PBS清洗2次，離心棄上清。加入150 μL PBS和5 μL表面抗體CD4(FITC通道)重懸細胞，避光室溫孵育20 min。PBS洗滌離心后進行固定、破膜、封閉等操作，加入150 μL PBS重懸細胞，標記每組的4管細胞分別為a、b、c、d。a管加入10 μL IL-17A(PE通道)進行直接熒光標記；b、c、d管分別加入10 μL STAT3、10 μL p-STAT3、10 μL RORγ-t一抗，避光室溫孵育1 h。加入PBS清洗兩次離心棄上清，a管直接加入250 μL PBS重懸細胞。b、c、d管分別加入10 μL相對應的熒光二抗(Alexa Fluor 647)進行間接熒光標記避光室溫孵育2 h，PBS清洗離心棄上清，加入250 μL PBS重懸細胞。a、b、c、d管經紗網過濾轉移至流式管，上機分別檢測人PBMCs中Th細胞中p-STAT3、STAT3、RORγ-t和IL-17A指標的變化。

2.4 Western blot檢測相關蛋白表達取人PBMCs細胞懸液接種于6孔板中，按照空白對照組、細胞刺激劑刺激組、CP-25組、艾拉莫德組、托法替布組進行刺激加藥處理，培養24 h后用移液槍轉移至ep管中，離心棄上清。加入預冷PBS緩沖液洗滌兩次，離心棄上清。按照RIPA ∶ PMSF ∶ 磷酸酶抑制劑=98 ∶ 1 ∶ 1的比例配制110 μL的細胞裂解液，加入配制好的細胞裂解液充分混勻，冰上裂解30 min后，冰上超聲1 min，4 ℃，12 000 r·min-1，15 min離心留上清，即為總蛋白。取10 μL樣品進行蛋白定量，剩余100 μL上清液加入蛋白上樣緩沖液混勻，沸水中煮10 min。配10%濃度的分離膠，經過上樣、電泳、轉膜和封閉等操作后，4 ℃孵育過夜一抗(1 ∶ 500)：p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-JAK3、JAK3、p-STAT3、STAT3、RORγ-t、IL-17A，次日孵育二抗，顯影。

3 結果

3.1 CP-25對人PBMCs增殖功能的影響采用CCK-8法分析CP-25對人PBMCs增殖功能的影響。Fig 1結果顯示，與空白對照組相比，用細胞刺激劑刺激人PBMCs 24 h后，PBMCs的增殖反應增強，差異有統計學意義(P<0.01)。與刺激組相比，CP-25、艾拉莫德和托法替布能明顯抑制細胞刺激劑誘導的人PBMCs的增殖反應(P<0.01)。提示CP-25能夠抑制體外誘導的人PBMCs異常增殖反應。

Fig 1 Effect of CP-25 on proliferation rate

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsstimulated

3.2 CP-25對人PBMCs中CD4+Th細胞的p-STAT3和STAT3表達的影響采用流式細胞術分析CP-25對人PBMCs中CD4+Th細胞的p-STAT3和STAT3表達的影響。與空白對照組相比，細胞刺激劑作用于人PBMCs 24 h后，可以明顯升高人PBMCs中Th細胞的p-STAT3和STAT3的表達，差異具有統計學意義(P<0.01)。與刺激組相比，CP-25、艾拉莫德和托法替布能明顯降低人PBMCs中Th細胞的p-STAT3和STAT3的表達，差異具有統計學意義(P<0.01)(Fig 2A和2B)。提示CP-25可能通過調節JAK/STAT3信號通路下調人PBMCs中Th細胞的中p-STAT3和STAT3指標。

3.3 CP-25對人PBMCs中CD4+Th細胞的RORγ-t表達和Th17細胞百分比的影響流式細胞術結果顯示，與空白對照組相比，細胞刺激劑作用于人PBMCs 24 h后，可以明顯升高人PBMCs中CD4+Th細胞的RORγ-t的表達和CD4+IL-17A+Th17細胞的百分比，差異具有統計學意義(P<0.01)。與刺激組相比，CP-25、艾拉莫德和托法替布能明顯降低人PBMCs中Th細胞的RORγ-t表達和CD4+IL-17A+Th17細胞的百分比，差異具有統計學意義(P<0.01)(Fig 3A和3B)。提示CP-25可能通過調控JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路抑制Th17細胞的分化。

3.4 CP-25對人PBMCs中JAK/STAT3信號通路的影響采用Western blot分析CP-25對人PBMCs中JAK/STAT3信號通路的影響。Fig 4 結果顯示，與空白對照組相比，細胞刺激劑作用于人PBMCs 24 h后，可以明顯升高人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3和STAT3蛋白表達，差異具有統計學意義(P<0.01)，而對JAK1、JAK2、JAK3蛋白表達無明顯作用。與刺激組相比，CP-25和托法替布能明顯降低人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3和STAT3蛋白表達，差異具有統計學意義。艾拉莫德能明顯降低人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3蛋白表達，差異具有統計學意義(Fig 4A和4B)。進一步驗證了CP-25對JAK/STAT3信號通路的調控作用。

3.5 CP-25對人PBMCs中RORγ-t、IL-17A蛋白表達的影響Western blot結果顯示，與空白對照組相比，細胞刺激劑作用于人PBMCs 24 h后，可以明顯升高人PBMCs中RORγ-t、IL-17A蛋白表達，差異具有統計學意義(P<0.01)。與刺激組相比，CP-25、艾拉莫德和托法替布能明顯降低人PBMCs中RORγ-t和IL-17A蛋白表達(P<0.01)，差異具有統計學意義(Fig 5A和5B)。進一步驗證CP-25可能通過調控JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路抑制Th17細胞的分化。

4 討論

4.1 CP-25是一個潛在炎癥免疫反應軟調節藥物已經上市的治療RA的藥物主要包括非甾體抗炎藥、甾體抗炎藥、傳統改善病情抗風濕藥等藥物，雖然治療作用明確但也存在不良反應。炎癥免疫反應軟調節(soft regulation of inflammatory immune responses, SRIIR)藥物能夠選擇性調控機體組織細胞功能、基因和蛋白異常變化所致的病理狀態并使其恢復至生理水平，該類藥物控制炎癥免疫應答相關細胞過度活化且不損害其生理功能，因此，研發SRIIR藥物是未來抗炎免疫藥物的一個趨勢[7]。課題組前期研究發現，CP-25能夠恢復干燥綜合征、佐劑性關節炎和膠原誘導性關節炎動物模型的炎癥指標，緩解關節腫脹、降低脾臟組織病理學評分。CP-25主要通過調節T、B細胞亞群的增殖、活化和分化[8]，抑制成纖維樣滑膜細胞[9]、內皮細胞的異常活化，抑制M1巨噬細胞活化，增強M2巨噬細胞極化，對免疫功能異常發揮調節作用[11]。CP-25還可以通過調節GRK2的685位絲氨酸的磷酸化,從而影響GRK2與EP4的結合,使EP4受體復敏，改善RA患者滑膜細胞株功能從而發揮治療RA的作用[12]。本實驗研究發現，TNF-α與細胞刺激混合物聯合刺激能誘發人PBMCs的異常增殖，CP-25能明顯抑制細胞刺激劑誘導人PBMCs的異常增殖，提示CP-25是一個潛在炎癥免疫反應軟調節藥物。

Fig 2 Effect of CP-25 on p-STAT3 and STAT3 expression of Th cells in human

A：Effect of CP-25 on p-STAT3 expression of Th cells in human PBMCs; B：Effect of CP-25 on STAT3 expression of CD4+Th cells in human PBMCs.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsstimulated

Fig 3 Effect of CP-25 on RORγ-t expression of Th cells and Th17 percentage in human

A：Effect of CP-25 on RORγ-t expression of CD4+Th cells in human PBMCs; B：Effect of CP-25 on CD4+IL-17A+Th17 percentage in human PBMCs.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsstimulated

4.2 CP-25可能通過調節JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路抑制Th17細胞的分化RA炎癥條件下，JAK/STAT3通路的激活使RORγ-t表達增加，RORγ-t 作為控制Th17細胞分化的關鍵轉錄因子，它的激活可以啟動Th17細胞的分化，并刺激Th17細胞分泌IL-17A[2]。除此之外，IL-6和TNF-α也可激活Th17細胞的分化以及IL-17A、IL-22等促炎癥因子的分泌。IL-17A具有強致炎作用，可誘導炎性細胞因子的產生和招募白細胞，在促炎癥反應和自身免疫性疾病中發揮著重要作用[13]。細胞刺激混合物主要成分包括佛波酯、離子霉素、布雷菲爾德菌素A，前兩者可以刺激細胞分泌IL-17A，第3個成分能夠抑制IL-17A穿過細胞膜分泌到細胞外。艾拉莫德是國家食品藥品監督管理局2011年8月臨床批準的Ⅰ類新藥，用于治療成人活動性RA。文獻報道艾拉莫德可以通過下調Th17細胞百分比，同時上調Treg細胞百分比來恢復RA患者內環境的細胞穩態，從而緩解疾病發展[14]。托法替布是一種與 ATP 高度相似、但無磷酸基團的小分子化合物，這種結構相似性使其能與 ATP 競爭性結合并抑制 JAK 激酶活性[15]。托法替布作為最早被批準用于治療RA的JAK抑制劑，能明顯抑制JAK3、JAK1活性，較小程度抑制JAK2活性，對RA等炎癥免疫疾病發揮治療作用，本實驗選用艾拉莫德和托法替布作為陽性對照藥。

Fig 4 Effect of CP-25 on JAK/STAT3 signaling

A:Expression of p-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-JAK3, JAK3, p-STAT3 and STAT3 protein was detected by Western blot; B: The difference of p-JAK1, p-JAK2, p-JAK3, p-STAT3 and STAT3 protein expression in human PBMCs between different groups was compared.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsstimulated

Fig 5 Effect of CP-25 on expression of RORγ-t and IL-17A protein in human

A:Expression of RORγ-t and IL-17A protein was detected by Western blot; B: The difference of RORγ-t and IL-17A protein expression in human PBMCs between different groups was compared.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsstimulated.

實驗結果發現，TNF-α與細胞刺激混合物聯合刺激的人PBMCs中CD4+IL-17A+Th17細胞的百分比顯著升高，CP-25能明顯降低人PBMCs中CD4+IL-17A+Th17細胞的百分比，抑制人PBMCs的異常增殖，這些結果表明CP-25可能通過抑制Th17細胞的分化抑制人PBMCs的異常增殖，緩解炎癥反應。流式細胞術實驗發現細胞刺激劑誘導人PBMCs中CD4+Th細胞的p-STAT3、STAT3、RORγ-t、IL-17A表達明顯升高，CP-25能明顯降低p-STAT3、STAT3、RORγ-t、IL-17A表達。為了進一步驗證CP-25是否通過調節JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路抑制Th17細胞的分化，我們采用Western blot實驗檢測通路相關蛋白。結果表明細胞刺激劑誘導人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3、STAT3、RORγ-t和IL-17A蛋白表達明顯升高，CP-25能明顯降低人PBMCs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3、STAT3、RORγ-t和IL-17A蛋白表達。上述結果提示CP-25可能通過調節JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路抑制Th17細胞的分化，從而調節T細胞的功能。

綜上所述，JAK/STAT3信號通路的激活促進了Th17細胞的分化，導致T細胞亞群失衡。CP-25可能通過調節JAK/STAT3/RORγ-t/IL-17A信號通路抑制Th17細胞的分化，參與T細胞亞群平衡的調節，提示CP-25具有良好的抗炎免疫軟調節活性。本研究為進一步闡明CP-25藥理作用機制以及將CP-25開發為治療RA的抗炎免疫軟調節藥物提供了實驗依據。