小鼠子宮中TRPC6通道在離體子宮收縮中的作用

馮 娜，呂偉禎，陳興娟

(1. 天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院藥劑科， 天津 300300；2. 西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院，陜西 西安 070012)

子宮過度收縮與年輕女性的原發(fā)性月經(jīng)痛和孕婦的早產(chǎn)密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在年輕女性中需要使用藥物來減輕原發(fā)性痛經(jīng)疼痛的比率高達(dá)55%[1]；孕婦早產(chǎn)的發(fā)生率在5%～15%之間[2]。子宮的收縮依靠肌層平滑肌的收縮。子宮平滑肌的收縮機(jī)制和分子通路與其它平滑肌相似——包括Ca2+的調(diào)控、肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白的相互作用等。Ca2+作為細(xì)胞的第二信使，參與許多重要的生命活動(dòng)，如細(xì)胞收縮、代謝、分泌和分化等。平滑肌細(xì)胞的Ca2+濃度的變化在子宮收縮過程中具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用。其中細(xì)胞外Ca2+通過鈣離子通道內(nèi)流是平滑肌細(xì)胞升高胞內(nèi)Ca2+濃度的重要途經(jīng)，與子宮平滑肌層收縮密切相關(guān)[3]。

經(jīng)典瞬時(shí)感受器電位通道6(transient receptor potential canonical 6, TRPC6)是一種對(duì)Ca2+具有通透性的非選擇性陽離子通道。TRPC6通道可以被細(xì)胞內(nèi)的第二信使二乙酰甘油(DAG)直接激活，而DAG來自于受體激活PLC水解PIP2而來，因此TRPC6屬于受體門控通道(receptor-operated channel, ROC)[4]。研究證據(jù)表明，TRPC6通道蛋白在腦組織，含有平滑肌的組織、腎臟組織以及一些免疫細(xì)胞中均有分布，并參與相關(guān)的生理活動(dòng)[5-8]。盡管在平滑肌細(xì)胞中，引起收縮的Ca2+內(nèi)流主要是通過細(xì)胞膜去極化激活電壓依賴性鈣離子通道來實(shí)現(xiàn)的，但是近年來一些研究表明TRPC6通道在血管平滑肌收縮過程中發(fā)揮重要作用，包括小血管、主動(dòng)脈血管和肺動(dòng)脈血管等[9]。而在子宮平滑肌層TRPC6通道蛋白也有明顯的分布，那么TRPC6通道在子宮收縮過程中扮演怎樣角色？

本研究以小鼠離體子宮為研究對(duì)象，使用藥理實(shí)驗(yàn)技術(shù)和基因敲除技術(shù)，研究TRPC6通道在小鼠離體子宮收縮過程中的作用；并進(jìn)一步分離小鼠子宮平滑肌細(xì)胞，在細(xì)胞水平驗(yàn)證TRPC6介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流在子宮收縮過程中作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究使用TRPC6-KO小鼠的種鼠購自Jackson Lab(Stock #37345-JAX)，實(shí)驗(yàn)使用的2～4個(gè)月小鼠，♀，體質(zhì)量(20±2)g，在西北工業(yè)大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房由種鼠繁殖而來。由于TRPC6-KO小鼠的基因背景是C57BL/6和129S小鼠雜交，因此對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的野生型小鼠(wildtype， WT)是野生型C57BL/6和129S小鼠雜交的第二代。C57BL/6和129S小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。使用異氟醚吸入麻醉小鼠后，斷頭處死。取出小鼠的子宮，清理子宮周圍的結(jié)締組織和脂肪。將子宮組織從子宮角的中部開始切割成3 mm長(zhǎng)的子宮小環(huán)。小鼠子宮角的近端部分用于所有實(shí)驗(yàn)。按照參考文獻(xiàn)所述，在取出子宮之前通過檢查PBS沖洗陰道液中的細(xì)胞含量和形態(tài)來確定小鼠發(fā)情周期階段[10]。

1.2 藥物與溶液標(biāo)準(zhǔn)Krebs緩沖液(單位：mmol·L-1)：130 NaCl、5 KCl、2 CaCl2、1.2 NaH2PO4、0.56 MgCl2、25 NaHCO3和5葡萄糖。70 mmol·L-1KCl溶液含有(單位：mmol·L-1)：65 NaCl、70 KCl、2 CaCl2、1.2 NaH2PO4、0.56 MgCl2、25 NaHCO3和5葡萄糖。

鈣成像和膜片鉗的細(xì)胞外液(單位：mmol·L-1)：145 NaCl，2.5 KCl，1.2 CaCl2、1 MgCl2、10 HEPES和5葡萄糖(用NaOH調(diào)節(jié)pH 7.2)。

OT，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：03251；His，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：59964。

1.3 等張張力檢測(cè)將子宮小環(huán)安裝在兩個(gè)平行支撐金屬絲上：一個(gè)起固定作用，另一個(gè)連接張力轉(zhuǎn)換器(FSG-01張力傳感器)。開始等張張力測(cè)試之前將子宮小環(huán)置于充滿6 mL Krebs液體的恒溫浴槽(37 °C，TSZ-04離體組織灌流系統(tǒng))中。通過調(diào)節(jié)金屬絲的位置給予每個(gè)實(shí)驗(yàn)子宮小環(huán)約0.5 g的負(fù)荷[11]。在Krebs液中平衡30 min至1 h，待子宮收縮平穩(wěn)，開始實(shí)驗(yàn)，使用Digidata 1440數(shù)字轉(zhuǎn)化儀記錄子宮小環(huán)的收縮。在記錄收縮力的同時(shí)，將所有藥物直接添加到組織浴中。本實(shí)驗(yàn)使用了離體的子宮小環(huán)而不是切開的子宮條去觀察子宮的收縮，一定程度保持子宮的完整。另外我們之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示子宮條和子宮小環(huán)對(duì)催產(chǎn)素(oxytocin，OT)的反應(yīng)沒有明顯的區(qū)別。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)子宮平滑肌的分離培養(yǎng)： 將分離的子宮角縱向切開，在解剖顯微鏡下去除內(nèi)膜層，將肌層剪碎。移置含有collagenase P (1 g·L-1)，0.2 mmol·L-1CaCl2和0.125% BSA的消化液中，37 ℃消化40 min。吹打消化液至看不見明顯的組織塊，過濾移除沒有消化的子宮組織。用PBS清洗消化下來的子宮平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后用于鈣成像實(shí)驗(yàn)。

過表達(dá)TRPC6通道的HEK細(xì)胞：使用Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen)，將TRPC6和H1受體的cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK細(xì)胞中，24 h后用于膜片鉗記錄TRPC6電流。

1.5 鈣成像和膜片鉗將培養(yǎng)過夜的子宮平滑肌細(xì)胞用PBS洗3遍后，加入4 μmol·L-1Fura-2AM，室溫放置1 h，使細(xì)胞充分負(fù)載鈣離子熒光染料。隨后使用PBS洗去溶液中的染料。使用Till-Photonics單細(xì)胞熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。使用熒光信號(hào)比(F345/F380)的變化指示鈣離子濃度的變化。使用細(xì)胞外高鉀溶液(140 mmol·L-1KCl)使細(xì)胞膜去極化，只有給予高鉀溶液后引起胞內(nèi)鈣離子升高的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)分析。

用Axopatch 200B放大器和Digidata 1550a數(shù)字化儀記錄全細(xì)胞膜片鉗模式下的TRPC6電流。pClamp 10軟件包用于采集控制和數(shù)據(jù)分析。在60 mV的鉗制電壓下，以2 s的間隔給與-100～100 mV的電壓刺激。TRPC6電流通過10 μmol·L-1的組胺(histamine， His)溶液激活。

1.6 PCR檢測(cè)TRPC6-KO小鼠基因型取小鼠耳朵小片組織置于含有125 μL裂解液(NaOH=25 mmol·L-1， EDTA=0.2 mmol·L-1，pH12 中90 ℃水浴中45 min，冷卻后，加入等體積的中和液(Tris HCl=40 mmol·L-1)。離心后，上清用于PCR。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，TRPC6的引物信息：野生型 WT-F 5′-TCT TTATGCAATCGCTGTGG-3′和WT-R 5′-GCTAGTCTTCCTGCAATCCA-3′。基因敲除型MUT-F 5′-TCTATTAACACTCAACTGGCACCT-3′和 MUT-R 5′-GCCAGAGGCCACTTGTGTAG-3′。PCR產(chǎn)物用于鑒定小鼠的基因型:Trpc6-/-175 bp 和WT 378 bp。

2 結(jié)果

2.1 TRPC6通道抑制劑對(duì)OT宮縮作用的影響Fig 1A所示，小鼠子宮小環(huán)在Krebs液中穩(wěn)定30～60 min后，收縮逐漸平穩(wěn)，向浴液中加入OT后，引起子宮組織強(qiáng)烈的收縮，并且隨著濃度的增加收縮逐漸增強(qiáng)。溶劑對(duì)照組(DMSO)中100 nmol·L-1OT引起收縮強(qiáng)度倍數(shù)增加為(13.2±4.0，n=7), 而Pyr10組，增加的倍數(shù)為(5.0±2.1，n=8)，P<0.05.說明TRPC通道抑制劑Pyr10(10 μmol·L-1)明顯抑制OT引起的子宮收縮(Fig 1B)。

為進(jìn)一步明確TRPC6在子宮收縮中的作用，在實(shí)驗(yàn)中使用特異性抑制TRPC6通道的Larixyl(10 μmol·L-1)[13]。Fig 1C 的結(jié)果顯示，Larixyl對(duì)OT的收縮作用也有明顯的抑制作用(增加的倍數(shù)為5.6±2.5，n=5)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，TRPC6通道抑制劑對(duì)離體小鼠子宮自發(fā)性的收縮沒有明顯的影響，但是明顯抑制了OT引起的子宮收縮，并且抑制作用在高濃度OT(100 nmol·L-1)下更明顯。

2.2 TRPC6-KO小鼠離體子宮的收縮因?yàn)檠芯恐惺褂玫腡RPC6-KO小鼠是表達(dá)不具功能的TRPC6通道蛋白，因此使用商品的TRPC6通道蛋白抗體不能鑒別TRPC6-KO小鼠。因此使用Jackson Lab推薦protocol，用PCR來鑒定。PCR結(jié)果(Fig 2A)顯示TRPC6-KO小鼠TRPC6基因?yàn)閙utant型。如Fig 2B所示，OT引起TRPC6-KO (n=7)小鼠子宮的收縮張力的變化明顯小于野生型(WT，n=5)小鼠。而在TRPC6-KO的小鼠子宮上，抑制劑larixyl(10 μmol·L-1)抑制OT(100 nmol·L-1)引起子宮收縮的作用明顯減弱(Fig 2C)。結(jié)果進(jìn)一步表明TRPC6通道參與OT引起的小鼠子宮的收縮。

2.3 TRPC6通道對(duì)OT引起小鼠離體子宮收縮張力-時(shí)間的影響在浴液中加入OT后，離體子宮小環(huán)在開始出現(xiàn)強(qiáng)烈的收縮，而后收縮比較均勻平穩(wěn)，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)子宮小環(huán)的收縮會(huì)逐漸降低(Fig 3C)。但在TRPC6-KO 小鼠子宮環(huán)上，OT引起收縮張力隨時(shí)間延長(zhǎng)，降低的速度要比WT緩慢(Fig 3A)。Fig 3B中對(duì)OT刺激后子宮每5 min平均收縮張力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)4個(gè)時(shí)段。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明OT刺激后10 min后，WT子宮小環(huán)收縮明顯減弱(n=5，第四個(gè)5 min與最初5 min平均收縮力的比值為0.23±0.06)，而TRPC6-KO子宮小環(huán)收縮減弱的幅度明顯比較小(n=7，第四個(gè)5 min與最初5 min平均收縮力的比值為0.69±0.02)。TRPC6通道可以被GPCR-PLC通路生產(chǎn)的DAG直接激活，但是，如Fig 3D所示，過表達(dá)H1受體和TRPC6通道的HEK細(xì)胞上，His(10 μmol·L-1)誘發(fā)的TRPC6通道電流在達(dá)到最大值后，即使繼續(xù)給予His刺激，電流幅度逐漸開始衰減[4]。因此OT縮宮作用衰減在TRPC6-KO子宮上有所緩解可能與TRPC6通道功能喪失有關(guān)。

Fig 1 OT-induced uterine contractions inhibited by Pyr10 and Larixyl A: DMSO; B: Pyr10; C: Larixyl; D: Summary data. *P<0.05 vs DMSO

2.4 OT引起的TRPC6-KO小鼠子宮平滑肌細(xì)胞鈣離子濃度變化的特征在分離的小鼠子宮平滑肌細(xì)胞上，可以清楚看到100 nmol·L-1OT引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯的升高，相應(yīng)的，升高的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)開始下降(Fig 4A)。對(duì)WT和TRPC6-KO兩組小鼠子宮平滑肌細(xì)胞的鈣離子濃度在受到OT刺激后隨時(shí)間衰減的時(shí)程曲線進(jìn)行Exponential(standard)擬合。用tau值來表示衰減速度。如Fig 4B所示，TRPC6-KO組tau值(s)明顯高于WT組(TRPC6-KO：68.7±12.3，n=10 vs WT: 38.8 ±11.8,n=8)。

3 討論

OT可以引起小鼠離體子宮強(qiáng)烈的收縮，是體外模擬痛經(jīng)子宮強(qiáng)烈收縮常用的工具藥物。研究結(jié)果表明，痛經(jīng)的年輕女性體內(nèi)OT水平明顯高于沒有痛經(jīng)的女性[14]。OT收縮子宮的作用主要是通過激活OT受體實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)OT受體被激活后由第二信使介導(dǎo)，通過平滑肌細(xì)胞膜上的鈣離子通道介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，和細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子升高細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，從而引發(fā)宮縮。在這一過程中參與鈣離子內(nèi)流的鈣離子通道主要包括電壓依賴性鈣離子通道和受體激活通道等。本研究所感興趣的TRPC6通道是受體調(diào)控的，對(duì)鈣離子據(jù)有通透性的通道之一。研究表明TRPC6在參與了血管平滑肌收縮的過程[9]。本文的結(jié)果表明，TRPC6通道的抑制劑對(duì)子宮自發(fā)性的收縮沒有明顯的影響，而比較明顯抑制了OT引起的子宮的強(qiáng)烈的收縮。可能是TRPC6通道在OT受體被激活時(shí)才打開，進(jìn)而介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，參與子宮的收縮。因此，TRPC6通道抑制劑的解痙作用可能會(huì)緩解子宮強(qiáng)烈收縮引起的痛經(jīng)。

Fig 2 Uterine contractions of TRPC6-KO mice

A: PCR; B: Summary of OT-induced TRPC6-KO mouse uterine contractions; C: Effects of DMSO and Larixyl on OT-induced TRPC6-KO mouse uterine contractions.*P<0.05vsWT

Fig 3 OT-induced uterine contraction in WT and TRPC6-KO mice

A: Represent uterine contraction traces from WT and TRPC6-KO mouse; B: Time-effect curves of WT and TRPC6-KO uterine contractions: the effect was presented by the ratio of each area under curve every five minutes and the first 5 minutes’; C: Histamine (His) induced TRPC6 current trace on HEK cells;D：Time trace of histamine induced TRPC6 current in HEK cells. The insert shows the sample current trace of current-voltage relationships acquired during the voltage ramps from -100mV to + 100 mV in HEK cells with TRPC6 overexpressing.**P<0.01vsWT

Fig 4 Fig 4. OT induces intracellular calcium signals in WT and TRPC6-KO uterine smooth muscle cells

A: Represent time-F345/F380 traces; B: Summary data comparing the decay time constants (tau, s) for the Ca2+transients shown in (A).*P<0.05vsWT

OT的作用比較迅速，給藥后很短時(shí)間就引起子宮的強(qiáng)烈收縮，但是隨時(shí)間的延長(zhǎng)，縮宮作用逐漸衰減。然而，TRPC6通道功能喪失后，OT縮宮作用的衰減變得緩慢。TRPC6通道電流被受體激活后也存在衰減，這與通道和受體自身的磷酸化以及胞內(nèi)鈣離子濃度升高有關(guān)[4]。結(jié)合TRPC6通道激活電流的特征和本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，OT縮宮作用隨時(shí)間的衰減可能與TRPC6通道電流的減小有關(guān)。但是值得注意的是，TRPC6功能喪失，OT縮宮作用的衰減減慢，但是依然存在。表明這是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能有多種機(jī)制參與其中，包括OT受體的下調(diào)等，其它參與機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。