補陽還五湯通過notch信號通路增強神經(jīng)干細(xì)胞移植對腦缺血/再灌注大鼠的腦保護(hù)作用

張紫微，翟 羽，張 怡，靳曉飛，董賢慧，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

缺血性腦卒中是當(dāng)今常見的高危疾病之一，因缺血后易造成永久性的損傷，且臨床治療手段有限，難以恢復(fù)死亡的神經(jīng)元，所以具有預(yù)后不佳、致死、致殘率高的特點[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞受損后可以通過神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)移植來彌補或拯救神經(jīng)元[2]，成為缺血性腦卒中的新型治療候選者[3]。Notch信號通路能夠調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷移和血管生成，在決定細(xì)胞命運中具有核心作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，激活狀態(tài)下的Notch信號通路主要通過調(diào)節(jié)下游效應(yīng)分子Hes1和Hes5來調(diào)控NSCs的增殖和分化[5]。補陽還五湯是王清任《醫(yī)林改錯》中的經(jīng)典方劑，在臨床中被廣泛用于治療缺血性腦卒中。補陽還五湯對神經(jīng)干細(xì)胞移植后腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用是本課題組的前期研究結(jié)果，并且Notch信號通路抑制劑可以通過影響該通路促進(jìn)腦缺血/再灌注大鼠NSCs移植后的神經(jīng)再生。但是，補陽還五湯對腦缺血/再灌注大鼠NSCs移植后的腦保護(hù)作用是否是通過調(diào)控Notch信號通路起作用的，鮮有報導(dǎo)。因此，本研究以腦缺血/再灌注大鼠模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)為研究對象，探討補陽還五湯是否通過調(diào)控Notch信號通路增強神經(jīng)干細(xì)胞移植對腦缺血/再灌注大鼠的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠80只，♂，清潔級，自北京維通利華公司購買，體質(zhì)量均在(275±2) g。公司生產(chǎn)許可證號為：SCXK(京)2016-0011。

1.2 試劑及藥品戊巴比妥鈉購于北京化學(xué)試劑公司(批號020402)；培養(yǎng)基的組成包括購于Gibco公司的DMEM/F-12(1 ∶ 1)(批號8119014)、B-27(批號1865349)和購于PeproTech公司的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(批號1210432-1)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)(批號1009390)；Notch1(批號5)、Hes1(批號3)抗體購于CST公司，Hes5抗體購于Abcam公司(批號GR214854-7)。DAPI染液(批號180118)、Nestin兔抗大鼠單克隆抗體(批號AF12261998)、Actin抗體(批號LS190312)、以及其他分析純試劑均購于賽維爾有限公司。補陽還五湯由黃芪120 g，赤芍5 g，當(dāng)歸尾6 g，紅花3 g，地龍3 g，桃仁3 g，川芎3 g組成，藥材購自河北樂仁堂藥業(yè)有限公司，煎藥濃縮至100 mL(1 mL約含1.43 g生藥)。

1.3 主要儀器超凈工作臺SW-CJ-2FD型、Heal Force二氧化碳培養(yǎng)箱HF240型、Stoelting全自動腦立體定位儀51700型；Leica包埋機EG11508、輪轉(zhuǎn)切片機RM2255、生物顯微鏡DMI3000B、光學(xué)顯微鏡DM5000B型；Eppendorf離心機；UVP凝膠成像機；Bio-Rad電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀。

1.4 提取、培養(yǎng)及鑒定NSCs[6]培養(yǎng)基由DMEM/F-12、B27、EGF、bFGF、配置而成。取購自維通利華公司的孕14 d大鼠，麻醉并酒精消毒后，剝出子宮，在超凈臺內(nèi)取胎鼠大腦皮質(zhì)，用眼科剪剪碎后，用手動吹打法使較大的組織變化為細(xì)胞懸濁液，并在吹打后使用細(xì)胞篩濾過以保證懸液均勻。離心5 min后取出，速率為1 000 r·min-1，傾倒上清液后加培養(yǎng)基，再次吹打懸浮，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱，密度1.0×109·L-1，恒溫37 ℃。在放有多聚賴氨酸包被蓋玻片的6孔板中接種已傳至第3代的細(xì)胞懸液，4 h后顯微鏡下觀察到神經(jīng)球已粘附于蓋玻片，貼孔板側(cè)壁輕柔吸去多余懸液，并用體積分?jǐn)?shù)0.04多聚甲醛固定，15 min后PBS輕柔沖洗3次，每次5 min(后續(xù)PBS沖洗均為3次，每次5 min)；室溫下質(zhì)量濃度3 g·L-1TritionX-100孵育，20 min后PBS沖洗；室溫下山羊血清封閉，30 min后PBS沖洗。之后滴加Nestin抗體(1 ∶ 200)，在4 ℃環(huán)境中孵育，過夜后在室溫避光環(huán)境下加入二抗(FITC)孵育，1 h后PBS沖洗；滴加DAPI染液孵育，10 min后PBS沖洗；取片加抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片，并檢測Nestin的表達(dá)。

1.5 模型制作及評價大鼠在造左側(cè)MCAO模型前禁食水，術(shù)前麻醉使用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的戊巴比妥鈉(1 mL·kg-1)根據(jù)重量計算后腹腔注射，操作臺上固定、消毒、備皮。頸總、頸內(nèi)和頸外動脈在頸部正中切開2 cm后，分離暴露；結(jié)扎3次頸外動脈后在前中結(jié)扎點間做一切口，用合適的線栓斜行插入，將頸總、頸內(nèi)動脈用血管夾夾閉，剪斷頸外動脈于后側(cè)結(jié)扎點前，借助中部結(jié)扎線使頸外離斷端與頸內(nèi)動脈入顱方向一致，松頸內(nèi)血管夾，插線栓至大腦中動脈,稍有阻力感后停止，線栓進(jìn)入約(19±1) mm。2 h后拔栓并系死前側(cè)結(jié)扎點,碘伏消毒，依次縫合切口,術(shù)后動物給與保暖至蘇醒[7]。術(shù)后24 h，做神經(jīng)功能評分確定模型是否成功，按Zea Longa 5分制處理：行為無改變?yōu)?分；右前爪無法舒展為1分；向右側(cè)行走轉(zhuǎn)圈為2分；行走向右側(cè)歪倒為3分；喪失自發(fā)活動與意識為4分。0分、4分動物死亡為模型失敗，不予選取，將1～3分大鼠納入實驗對象。

1.6 分組及給藥實驗分組為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、補陽還五湯組(BYHWT)、移植組(Transplant)、補陽還五湯+移植組(BYHWT+Transplant)，每組各16只；其中假手術(shù)組只分離血管，其余4組隨機平均分配64只模型成功大鼠。BYHWT組與BYHWT+Transplant組于手術(shù)麻醉清醒2 h后，灌胃給予補陽還五湯，給藥劑量為14.8 g·kg-1·d-1，每日灌藥量分兩次給予，連續(xù)灌胃14 d，其余3組給予等體積蒸餾水。各組大鼠于NSCs移植后第14 d進(jìn)行取材。

1.7 NSCs移植[8]模型制作24 h后進(jìn)行NSCs移植，麻醉消毒，固定大鼠于腦立體定位儀上,以前囟為坐標(biāo)零點定位:AP=0.36 mm,ML=3.15 mm,DV=5.5 mm,微量注射器注射速度:1 μL·min-1，細(xì)胞濃度為1.0×106·L-1，注入NSCs 10 μL于大鼠左側(cè)紋狀體區(qū)，完畢后留針10 min拔針，消毒縫合。

1.8 TTC染色檢測大鼠迅速斷頭取腦，在置于質(zhì)量濃度20 g·L-1的TTC染液前，放在-20 ℃環(huán)境15 min,并于取出后的腦槽內(nèi)做5片，2 mm厚冠狀切片；37 ℃恒溫箱中避光孵育,10 min后翻面1次,20 min后在體積分?jǐn)?shù)0.04的多聚甲醛中固定。24 h后拍照，腦梗死體積圖片的分析使用Image-Pro Plus 6.0軟件。

1.9 HE染色觀察梗死區(qū)腦組織細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛灌注取腦，腦組織石蠟包埋，做冠狀切片，厚5 μm。60 ℃烘烤石蠟切片2 h后，依次于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中脫蠟 ，每次15 min，然后于梯度乙醇脫水，每次5 min，依次為體積分?jǐn)?shù)1的乙醇Ⅰ、Ⅱ和體積分?jǐn)?shù)0.8的乙醇；蒸餾水復(fù)水、蘇木素染液染色各5 min，流動水輕洗數(shù)秒，分化3 s，水洗反藍(lán)少于30 s，過洗2 s，伊紅染液浸染1～3 min，蒸餾水輕洗1～2 s；再次梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，樹膠封片，鏡下拍照，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并觀察腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷情況。

1.10 Western blot法檢測各組大鼠快速在冰上斷頭，取缺血側(cè)腦組織；稱重后，加入裂解液勻漿，取上清(組織總蛋白)。BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。加樣后，用SDS-PAGE凝膠電泳，傳至PVDF膜；室溫下，質(zhì)量濃度50 g·L-1脫脂奶粉封閉，2 h后分別加入兔抗大鼠Actin(1 ∶ 2 000)、Notch1、Hes1、Hes5(1 ∶ 1 000)抗體，4 ℃孵育過夜；室溫下加入二抗(1 ∶ 2 000)孵育，1 h后洗膜，避光并滴加ECL顯影，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察。以β-actin作內(nèi)參照，以目的條帶灰度值與內(nèi)參照條帶灰度值之比分析蛋白質(zhì)的相對表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的證明如Fig 1所示，在倒置顯微鏡下對培養(yǎng)6 d的新生大鼠腦組織原代細(xì)胞進(jìn)行觀察，觀察發(fā)現(xiàn):視野中存在多個懸浮、規(guī)則、無突起的桑葚狀致密細(xì)胞球和大量單細(xì)胞。免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示:具有熒光特性的FITC標(biāo)記的Nestin發(fā)出綠色熒光；細(xì)胞核被DAPI核染，發(fā)出藍(lán)色熒光，表明Nestin表達(dá)呈陽性，提示培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs。

2.2 神經(jīng)功能學(xué)評分比較如Fig 2，Sham組為0分。Model組較Sham組評分增加(P<0.05)；BYHWT組、Transplant組和BYHWT+Transplant組較Model組評分均降低(P<0.05)；BYHWT+Transplant組較Transplant組評分進(jìn)一步降低(P<0.05)。

Fig 1 Immunofluorescence identification of neural stem cells

A: 6 d neural stem cells; B: Positive cells were stained with nestin immunofluorescence; C: DAPI; D.Merge

Fig 2 Neurological score of each group

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vstransplant group.

2.3 腦梗死體積比較如Fig 3所示，Sham組無白色梗死灶形成。與Sham組比較，Model組缺血側(cè)梗死區(qū)體積較大(P<0.05)； BYHWT組、Transplant組和BYHWT+Transplant組較Model組相比，梗死體積均縮小(P<0.05)；BYHWT+Transplant組較Transplant組梗死體積進(jìn)一步縮小(P<0.05)。

2.4 缺血側(cè)腦組織HE染色比較如Fig 4所示，Sham組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞大小形態(tài)基本一致，分布均勻、致密，結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)充盈，核仁清晰，未見空泡狀水腫和變性，未見明顯核固縮與核溶解；與Sham組比較，Model組大鼠腦組織大量細(xì)胞受損嚴(yán)重，分布稀疏，出現(xiàn)較多空泡狀水腫、變性，以及核固縮和核溶解，皺縮細(xì)胞核數(shù)量增多(P<0.05)；BYHWT組、Transplant組和BYHWT+Transplant組分別與Model組比較，細(xì)胞狀態(tài)表現(xiàn)出不同程度的減輕，核收縮和溶解的細(xì)胞數(shù)有一定程度的降低(P<0.05)；BYHWT+Transplant組較Transplant組損傷程度進(jìn)一步減輕(P<0.05)。

Fig 3 TTC staining results of each group

2.5 各組Notch1、Hes1、Hes5蛋白表達(dá)如Fig 5所示，Sham組 Notch1、Hes1、Hes5蛋白均有一定量的表達(dá)，與Sham組比較，Model組Notch1、Hes1、Hes5蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05)；BYHWT組、Transplant組、BYHWT+Transplant組較Model組，各項蛋白表達(dá)均有所上調(diào)(P<0.05)；BYHWT+Transplant組較Transplant組各項表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。

3 討論

缺血性腦卒中的治療是當(dāng)今備受關(guān)注和亟待解決的關(guān)鍵問題，如何有效緩解腦損傷成為治療的首要關(guān)注點。腦損傷的修復(fù)受到多種因素的調(diào)控，其中通過經(jīng)典的Notch信號通路調(diào)節(jié)NSCs的增殖和分化被多數(shù)研究認(rèn)可[9]。Notch通路受體蛋白(Notch1～4)激活后與相鄰配體結(jié)合，經(jīng)過多次介導(dǎo)啟動下游堿性螺旋-環(huán)-螺旋基因：Hes1和Hes5效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄。研究證明，機體調(diào)控NSCs的增殖、分化與Notch1、Hes1和Hes5的活化密切相關(guān)。NSCs細(xì)胞周期的退出以及過早分化與Notch1受體表達(dá)減弱有關(guān)；Hes1與抑制NSCs分化有關(guān)；而Hes5可以促進(jìn)NSCs的增殖，它們共同參與維持神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量與種類的穩(wěn)定[10]。

Fig 4 HE staining of brain tissues in each group of rats (Bar=100 μm)

腦卒中屬于中醫(yī)中風(fēng)病的范疇，缺血性腦卒中的主要病機為氣虛血瘀。針對病機治療的補陽還五湯在長期臨床實踐中證明療效卓越?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可以從抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞毒性、抑制炎癥介質(zhì)等方面負(fù)向調(diào)控；也可以從促進(jìn)NSCs增殖分化、促進(jìn)相關(guān)生長蛋白表達(dá)、促進(jìn)信號通路激活等多個方面正向調(diào)控，共同發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[11]。

Fig 5 Western blot results

本研究結(jié)果顯示在腦缺血/再灌注損傷發(fā)生后，MCAO大鼠腦組織Notch1、Hes1、Hes5表達(dá)顯著升高，表明機體內(nèi)源性激活Notch1、Hes1、Hes5，參與修復(fù)受損部位，與涂建鋒等[12]的研究結(jié)果一致。單純進(jìn)行補陽還五湯與單純進(jìn)行外源性NSCs移植治療14 d后，Notch1、Hes1、Hes5表達(dá)增加，腦組織細(xì)胞與神經(jīng)功能有所恢復(fù)，說明Notch信號通路被激活并對腦缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用[13-14]。然而前期研究結(jié)果顯示，外源性NSCs移植治療7 d后Notch相關(guān)蛋白表達(dá)減少，神經(jīng)保護(hù)作用與Notch通路促進(jìn)外源性NSCs的分化有關(guān)[8]，結(jié)合本實驗我們猜測NSCs移植對Notch信號通路的影響可能是動態(tài)的，結(jié)果的差異性可能是因為NSCs移植在抑制Notch通路而促進(jìn)外源性NSCs分化的同時，還參與了腦組織內(nèi)環(huán)境與炎癥反應(yīng)的改變[15]，故表現(xiàn)為前期外源性NSCs分化程度較內(nèi)源性NSCs增殖程度明顯，但是隨著時間的增加，外源性NSCs分化逐漸穩(wěn)定，炎癥反應(yīng)降低，內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定，使Notch信號通路被激活，促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖。隨后我們研究腦缺血/再灌注損傷的修復(fù)作用是否能在NSCs移植與補陽還五湯的共同作用下，通過調(diào)控Notch信號通路而提高。研究結(jié)果證實：BYHWT+Transplant組各項蛋白明顯上調(diào)，腦組織與細(xì)胞的恢復(fù)明顯優(yōu)于Transplant組。由此我們認(rèn)為補陽還五湯可能是通過上調(diào)Notch信號通路，為移植后的內(nèi)源性NSCs長期保持增殖水平提供了保障，提高了內(nèi)源性NSCs增殖的潛能，彌補了移植后快速分化帶來的治療短暫性，從而增加了NSCs移植對腦缺血/再灌注損傷治療的持續(xù)性，并發(fā)揮更持久的腦保護(hù)作用。