基于網絡藥理學探討山海丹顆粒治療勃起功能障礙的潛在作用機制

錢 程，成 鵬，鄭維維，余蘇云，吳佳偉，鄭孟凱，陳文星，陸 茵,2，王愛云,2

(南京中醫藥大學 1.藥學院、江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2.中藥品質與效能國家重點實驗室(培育)，江蘇 南京 210023； 3.杭州施強藥業有限公司，浙江 杭州 310000)

中藥復方山海丹顆粒主要功效為活血化瘀、宣痹通絡、益氣養血，其組成有丹參、決明子、葛根、山羊血、麥冬、靈芝、人參、佛手、黃芪、紅花、香附、蒲黃、海藻、何首烏、川芎、三七16味中藥。4味活血化瘀藥丹參、紅花、三七、山羊血相須配伍，入心散血中之滯，入肝理血之壅。4味補氣藥人參、黃芪、何首烏、靈芝同用，益氣養血，補氣以促血行。川芎活血行氣、香附行氣解郁、佛手疏肝理氣，這3味藥可加強行氣活血作用。蒲黃化瘀、海藻散結，麥冬清心、葛根生津、決明子清熱，可以輔助活血發揮益氣養血功效，并滋陰復脈。山海丹顆粒主要發揮活血功效，并輔以補氣，臨床用以治療胸痹、心梗等疾病。中醫認為勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是經由臟腑、經絡、氣血津液相互協調作用的結果。有學者認為勃起功能障礙因于肝者居多，應從肝治[1]。肝藏血，主疏泄，主宗筋，肝血在肝氣疏導下對陰莖的快速充盈是陰莖勃起的物質基礎[2]。而山海丹顆粒可以調達肝氣，散肝血之壅，具有中醫理論上治療ED的潛在可能。現代醫學認為，ED本質是一系列神經血管活動，陰莖勃起需要副交感神經興奮，動脈擴張，動脈血流增加，海綿體充血膨脹[3]。動脈粥樣硬化、高脂血癥等血管性疾病常會引起ED發生，對血管具有調節作用的山海丹顆粒存在治療ED的作用基礎。

網絡藥理學是新興藥理研究方法，綜合計算生物學、系統生物學和網絡分析等多學科技術，旨在探究藥物與疾病的關聯性，具有系統性及整體性的特點[4]。單靶點機制通路的研究方法難以解釋中藥多成分、多靶點的協同作用，中藥配伍運用注重整體協調性，而這與網絡藥理學特點十分契合。目前，許多關于網絡藥理學的研究成功應用于中藥的機制探究，揭開了中藥發揮藥效的途徑，闡釋了中藥的科學內涵[5]。

據此，本研究基于網絡藥理學探討山海丹顆粒治療ED的潛在作用機制，為山海丹顆粒擴大適應癥提供依據和新思路。

1 材料與方法

1.1 山海丹顆粒成分庫的構建及活性成分篩選山海丹顆粒包含丹參、決明子、葛根、山羊血、麥冬、靈芝、人參、佛手、黃芪、紅花、香附、蒲黃、海藻、何首烏、川芎、三七16味中藥，通過查詢上海有機所中藥天然產物數據庫、 中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)、中藥信息庫(traditional chinese medicine information database，TCMID)，查找復方中已被鑒定的中藥化學成分，將這些成分搜集并整合，構建中藥復方成分數據庫。口服中藥要發揮藥效，必須克服機體藥代動力學屏障，經過吸收、分布、代謝、排泄等過程。一些成分由于半衰期短、脂溶性差、細胞滲透性差等原因，最終無法成為發揮藥效的活性成分。中藥復方組成復雜、成分眾多，很多藥效發揮依賴于微量成分協同作用，而傳統檢測手段很難將發揮作用的成分完全檢測出來。利用TCMSP數據庫ADME預測功能篩選復方成分中的活性成分口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug-like,DL)是中藥成分在ADME中的關鍵參數，可以作為篩選中藥發揮藥效活性成分的條件。在TCMSP數據庫中，設定篩選參數：OB≥30%，DL≥0.18。

1.2 山海丹顆粒潛在靶標預測及成分靶點網絡圖的構建通過整合分子靶標預測模型數據庫：Similarity Ensemble Approach (SEA)，STITCH和Benchmark Database通過模擬及比對計算，預測山海丹顆粒活性成分對應的所有分子靶標集。在總集中，運用化學基因組學整合手段，基于支持向量機和隨機森林算法計算出總靶點集中所有靶點與成分相互作用的強度。最終選取總集中支持向量機和隨機森林數值分別大于0.8和0.7的靶點作為潛在藥效靶標子集。通過Uniprot數據庫，對潛在藥效靶標進行分析和注釋，查找靶蛋白的基因名、Uniprot ID，保留人源靶點，并刪除重復項。使用Cytpscape3.2.1軟件繪制山海丹顆粒所含主要中藥-靶點圖。

1.3 勃起功能障礙疾病靶點庫的構建通過Therapeutic Target Database(TTD)數據庫、PharmGkb數據庫輸入疾病名稱“Erectile dysfunction”，得到疾病ED相關靶點名稱。利用Disease Gene Search Engine with Evidence Sentences(DiGSeE)數據庫，輸入疾病名稱“Erectile dysfunction”，選擇“Gene expression”，文本挖掘ED相關靶點名稱。將得到的靶點整合，基因名轉化并保留人源靶點，刪除重復項。

1.4 PPI網絡拓撲分析和核心靶點篩選利用Cytpscape 3.2.1軟件將山海丹顆粒潛在靶點和ED相關靶點進行PPI網絡拓撲分析，分別得到兩個拓撲網絡。利用Cytpscape 3.2.1軟件的插件CytoNCA將兩個拓撲網絡進行Merge，生成兩個拓撲網絡的交集網絡，得出中藥山海丹顆粒可作用于ED的靶點，以及Degree值等數據。通過交集網絡的拓撲數據分析出Degree值為33，定義大于2倍Degree值為Big Hubs，依據較高Degree值篩選得到核心網絡靶點。將關鍵靶點導入DisGeNET數據庫，獲取基因對應蛋白及蛋白分類。

1.5 核心靶點的功能注釋分析DAVID數據庫支持基因和靶蛋白列表分析的網絡數據庫。使用DAVID數據庫對PPI核心靶點進行GO注釋和KEGG富集分析，尋找出山海丹顆粒中有效成分可能參與調控的基因網絡中的潛在靶點、信號通路及相關生物學過程、細胞組分和分子功能。用OmicShare工具對KEGG富集通路繪制氣泡圖。使用Cytocape 3.2.1軟件中的ClueGO插件進行富集分析，構建靶蛋白參與的信號通路可視化結果。

1.6 蛋白相互作用網絡構建與分析GeneMANIA數據庫包含大量蛋白相互作用關系，將山海丹顆粒治療ED的核心靶點導入該數據庫，選擇Homo sapiens，進行蛋白相互作用分析。

2 結果

2.1 山海丹顆粒成分庫的構建及活性成分篩選通過上海有機所中藥天然產物數據庫、TCMSP數據庫和TCMID數據庫查找中藥成分，復方中已被鑒定的中藥化學成分為丹參、三七、紅花、人參、黃芪、何首烏、靈芝、決明子、葛根、佛手、香附、蒲黃、海藻、川芎、麥冬。最終構建的中藥復方成分庫包含1 571個成分，其中丹參202個成分，三七119個成分，紅花189個成分，人參190個成分，黃芪87個成分，何首烏19個成分，靈芝242個成分，決明子68個成分，葛根18個成分，佛手81個成分，香附104個成分，蒲黃33個成分，海藻20個成分，川芎189個成分，麥冬10個成分。基于TCMSP數據庫OB、DL篩選指標共選出了268個潛在活性成分，刪除重復項為226個活性成分。其中丹參64個成分，三七8個成分，紅花22個成分，人參22個成分，黃芪20個成分，何首烏11個成分，靈芝61個成分，決明子14個成分，葛根4個成分，佛手5個成分，香附18個成分，蒲黃8個成分，海藻4個成分，川芎7個成分，麥冬0個成分。

2.2 山海丹顆粒潛在靶標預測及成分靶點網絡圖的構建通過SEA、STITCH、Benchmark Database和Uniprot數據庫預測，得到中藥活性成分的潛在作用靶點。刪除重復項，共有186個潛在作用靶點，其中丹參活性成分潛在作用靶點76個，三七活性成分潛在作用靶點117個，紅花活性成分潛在作用靶點121個，人參活性成分潛在作用靶點94個，黃芪活性成分潛在作用靶點140個，何首烏活性成分潛在作用靶點52個，靈芝活性成分潛在作用靶點53個，決明子活性成分潛在作用靶點59個，葛根活性成分潛在作用靶點60個，佛手活性成分潛在作用靶點12個，香附活性成分潛在作用靶點128個，蒲黃活性成分潛在作用靶點130個，海藻活性成分潛在作用靶點85個，川芎活性成分潛在作用靶點32個。利用Cytpscape 3.2.1軟件繪制山海丹顆粒中藥-靶點作用圖(Fig 1)。

Fig 1 Major Chinese medicine -target networkof Shanhaidan granules

2.3 勃起功能障礙疾病靶點庫的構建通過TTD、PharmGkb和DiGSeE數據庫得到ED相關基因，得到82個疾病作用靶點。利用Cytpscape 3.2.1軟件繪ED-靶點作用圖(Fig 2)。

Fig 2 ED-target network

2.4 PPI網絡拓撲分析和核心靶點篩選通過PPI網絡拓撲分析，得到山海丹顆粒潛在靶點拓撲網絡，包含6 679個節點，148 186條邊；ED相關靶點拓撲網絡，包含2 550個節點，58 997條邊。使用CytoNCA分析后的交集網絡包含2 032個節點，52 284條邊(Fig 3)。取Degree值大于33的基因作為核心靶點，得到絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、一氧化氮合酶2(nitric oxiden synthase 2，NOS2)、磷脂酰肌醇-3-激酶調節亞基2(phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 2，PIK3R2)等基因，查到基因對應蛋白并進行蛋白分類(Tab 1)。這些蛋白與ED疾病的發生發展密切相關，說明山海丹顆粒可能通過這些蛋白發揮對ED的潛在治療作用。

Fig 3 Core target intersection PPI network

2.5 核心靶點的功能注釋分析山海丹顆粒GO分析顯示，山海丹顆粒預測的核心靶點在生物學過程中排名靠前的有缺血反應、調控血管生成、調控凋亡過程、細胞增殖以及衰老等，表明山海丹顆粒可能通過調控這些生物學進程從而影響疾病。細胞組分方面包括細胞-細胞粘附連接、細胞核核小體、肌動蛋白細胞骨架、膜筏、血液微粒等。分子功能主要涉及核苷酸結合、蛋白復合物結合、激酶活性、蛋白異二聚化活性、鈣粘蛋白結合參與細胞-細胞粘附等方面(Fig 4 )。

使用 DAVID 進行山海丹顆粒靶點KEGG通路分析，選取P 值相對較小且靶點富集的20條通路，主要有環磷酸鳥苷/蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinases G， cGMP/PKG)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated pro-tein kinase， MAPK)信號通路、凋亡途徑、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B， PI3K/Akt)信號通路(Fig 5 )。

Tab 1 Major potential targets of core network

Fig 4 Biological function analysis of Shanhaidangranules in treating ED targets

使用Cytocape3.2.1軟件中的ClueGO插件進行富集分析，構建靶蛋白參與的信號通路可視化結果，發現山海丹顆粒發揮藥效主要與cGMP/PKG信號通路、PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路等相關(Fig 6)。

此分析結果也可與KEGG分析結果相互佐證，說明山海丹顆粒治療ED的潛在作用機制與cGMP/PKG信號通路、MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路和凋亡途徑有關，為山海丹顆粒治療ED的實驗研究提供相關通路檢測的依據。

Fig 5 KEGG pathway in treatment of EDtarget by Shanhaidan granules

Fig 6 Signal pathway enrichment anlysis of Shanhaidangranules in treatment of ED core targets

2.6 蛋白相互作用網絡構建與分析通過GeneMANIA構建蛋白相互作用網絡并預測主要功能,發現有意義的功能主要包括：① 調節細胞凋亡信號通路；②正向調節MAPK級聯信號；③調節cGMP生物合成過程；④絲氨酸/蘇氨酸激酶活性；⑤ NO代謝過程。提示山海丹顆粒可能通過關鍵蛋白參與的相關信號通路發揮對ED的潛在治療作用(Fig 7)。

Fig 7 Key protein interaction network of Shanhaidangranules in treating ED and functional notes

3 討論

本研究基于網絡藥理學大數據信息分析的方法，深入探討了山海丹顆粒治療勃起功能障礙的潛在作用機制。通過數據庫找出山海丹顆粒的主要活性成分及治療ED的潛在作用靶點，如MAPK、NOS、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、叉頭形蛋白O(forkhead box protein O，FOXO)等。通過多個數據庫查找山海丹顆粒治療ED的通路并相互佐證，總結出4條潛在治療的機制通路，即為：cGMP/PKG信號通路、MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路、凋亡途徑。

山海丹顆粒治療ED的核心靶點185個，主要有TNF、FOXO、NOS、MAPK等。TNF-α對血管具有直接作用，在ED患者中高水平表達，可激活MAPK、PI3K/Akt等信號通路，這也可能是TNF-α對ED的調節機制[6]。FOXO在衰老過程中發揮對神經的保護作用，衰老是ED發生的重要因素，會引起nNOS表達下降以及內皮細胞過度凋亡，引發ED[7]。NO由eNOS、iNOS、nNOS三種不同類型一氧化氮合酶產生， NO誘導cGMP活化與積累，影響平滑肌松弛和陰莖勃起。血管和海綿體竇腔內皮細胞中的eNOS是NO的重要來源，內皮細胞過度凋亡會減少NO的合成和釋放，從而影響陰莖勃起。

cGMP/PKG途徑可以調節NO的血管舒張作用，副交感神經興奮會刺激神經元釋放NO，NO則激活鳥苷酸環化酶促進cGMP合成，陰莖組織中的cGMP介導陰莖勃起，cGMP被磷酸二酯酶過度降解則會導致勃起障礙[8]。cGMP通路也是目前關于ED研究較多的機制通路。

cGMP除了受NO影響，也受到MAPK通路的調節，從而導致ED的發生。MAPK信號通路在細胞分化、增殖及凋亡過程中發揮重要作用，這與ED的發生發展密切相關。RhoA/Rock通路的激活會導致陰莖松弛，并且是MAPK通路上游的調節因子[9]。MAPK信號通路中主要包括細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和p38MAPK。ED患者ERK活化水平顯著高于非ED患者，ERK能夠調控eNOS，抑制ERK信號通路可以降低精氨酸酶活性，改善海綿體的舒張功能[10]。p38可增強精氨酸酶活性，引起內皮細胞功能異常。p38與血管炎癥、內皮細胞凋亡、內皮細胞功能障礙有關，p38MAPK通路的激活是提高精氨酸酶活性在內皮細胞中表達的關鍵[11]。

內皮細胞過度凋亡會引起NOS活性降低導致NO合成受阻，從而抑制陰莖勃起。衰老、糖尿病、高脂血癥等疾病都會導致內皮細胞凋亡，eNOS水平降低，抑制了Bcl-2與Bax的比值[7]。5型磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesterase type 5 inhibitors，PDE5-I)作為治療ED一線藥物，其機制就是抑制PDE5，減少cGMP的降解，導致平滑肌松弛，抑制超氧化物生成，減少細胞凋亡從而提高NO含量。陰莖海綿體平滑肌細胞過度凋亡會使平滑肌數量降低，導致靜脈性ED發生。有研究對非動脈性重度ED患者的組織學進行檢測，發現陰莖海綿體平滑肌占陰莖海綿體結構的比例較正常，對照組顯著降低，這是靜脈性ED發生的重要原因[12]。

PI3K/Akt信號傳導途徑對細胞影響廣泛，包括細胞分化、增殖、凋亡等。活化的Akt可以通過磷酸化直接激活eNOS，促進NO的合成。eNOS依賴于Akt磷酸化介導陰莖勃起，A2B腺苷受體通過PI3K/Akt信號激活的eNOS促進陰莖勃起[13]。陰莖海綿體平滑肌細胞和血管內皮細胞的血小板衍生生長因子在缺氧環境下分泌增多，通過PI3K/Akt信號傳導增加連接蛋白的表達，并導致了ED，靶向該途徑可成為治療ED的有效策略[14]。

山海丹顆粒臨床常應用于治療冠心病、心絞痛，且療效較好。使用山海丹顆粒治療ED的實驗及臨床報道較少，尚未廣泛應用。有學者臨床使用山海丹顆粒聯合復方玄駒膠囊治療高脂血癥伴隨勃起功能障礙，結果發現可降低血脂水平并提高勃起功能，效果顯著[15]。該報道也一定程度上證實了山海丹顆粒治療ED的可行性。ED發病機制復雜，單一靶點的抑制劑藥物臨床有效率有限，而山海丹顆粒可靶向多條通路及多個靶點，發揮中藥復方治療優勢。利用網絡藥理學探究山海丹顆粒治療ED的潛在作用機制，能夠為山海丹顆粒擴大適應癥和臨床治療ED提供思路和依據，其具體作用機制仍然需要進一步的實驗驗證以及臨床檢驗。