miR-486在低氧誘導(dǎo)肺間質(zhì)纖維化中的調(diào)控作用及機(jī)制

石雪峰，王楷博，張紅衛(wèi)，閆曉潔，解友邦，顧玉海

肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis，PF)病因不明，早期或類型比較明確的,可以給予激素、抗炎等治療延緩疾病發(fā)展進(jìn)程。若疾病進(jìn)展至晚期，除了肺移植外，尚無其他有效治療藥物。因此，對PF發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究并探索防治新策略迫在眉睫。

有研究[1]表明低氧參與了誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)病過程，而既往研究[2]發(fā)現(xiàn)miR-486是一種低氧相關(guān)miRNA。且有研究[3]顯示miR-486參與了博來霉素誘導(dǎo)的肺組織損傷過程，故現(xiàn)通過對人胚肺成纖維細(xì)胞(medical research council cell strain 5,MRC5)分別進(jìn)行低氧處理及慢病毒轉(zhuǎn)染，探索在低氧相關(guān)PF發(fā)病過程中miR-486的調(diào)控作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)MRC5細(xì)胞購自協(xié)和細(xì)胞庫。細(xì)胞常氧培養(yǎng)用CO2培養(yǎng)箱，根據(jù)實驗室前期實驗基礎(chǔ)，細(xì)胞低氧處理培養(yǎng)箱條件設(shè)置為：37 ℃、1% O2、94% N2、5% CO2，低氧培養(yǎng)時間分別選擇0、6、12、24和48 h。MRC5細(xì)胞miR-486的過表達(dá)及沉默利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)。

1.2 試劑與儀器胎牛血清購自美國Applied Stem Cell公司；細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，慢病毒載體的構(gòu)建和病毒的包裝自行完成；TRIzol購自美國Invitrogen公司；miR-486引物、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測試劑盒購自美國ABI公司; 普通反轉(zhuǎn)錄試劑盒自購日本TaKaRa公司; 紫外分光光度儀、PCR儀、7500 FAST qPCR儀分別購自美國Thermo公司、伯樂公司、ABI 公司。

1.3 qRT-PCR檢測MiR-486、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)、膠原蛋白Ⅰ型(Collagen Ⅰ) 及Collagen Ⅲ mRNA的表達(dá) 收集低氧處理、過表達(dá)miR-486及沉默miR-486的MRC5細(xì)胞，加入TRIzol，按照RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，并用分光光度計檢測提取到的RNA的濃度及純度。以β-actin為內(nèi)參，按照日本TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過SYBR法檢測肺間質(zhì)纖維化相關(guān)基因(FN、α-SMA、Collagen Ⅰ及Ⅲ)的表達(dá)，循環(huán)數(shù)設(shè)置為40個循環(huán)，以2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。以U6為內(nèi)參，按照ABI公司Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書及特定引物進(jìn)行miRNA特異性反轉(zhuǎn)錄獲得的U6及miR-486 cDNA模板，通過探針法檢測miR-486的表達(dá)情況，循環(huán)數(shù)為40個循環(huán)，以2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。

1.4 Western blot檢測p-SMAD2及GAPDH的表達(dá)分別收集低氧0、24、48 h及過表達(dá)miR-486、沉默miR-486 MRC5細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)及二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DDT)的RIPA裂解液裂解細(xì)胞后收集蛋白進(jìn)行蛋白的表達(dá)檢測[1-2]，簡要步驟為提取蛋白后按照說明書用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入SDS凝膠加樣緩沖液后煮沸10 min變性，然后進(jìn)行跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉及加1 ∶1 000稀釋的一抗(p-SMAD2、GAPDH，美國Cell Signaling Technology)4 ℃慢搖過夜，第2天進(jìn)行洗膜3次、加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(羊抗兔/羊抗鼠，1 ∶2 000稀釋)室溫慢搖1 h、洗膜3次，最后加發(fā)光液檢測蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 低氧環(huán)境對MRC5細(xì)胞miR-486、PF相關(guān)基因及p-SMAD2表達(dá)的調(diào)控作用分別收集低氧培養(yǎng)0、6、12、24 和48 h后的MRC5細(xì)胞提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后分別檢測了miR-486及肺間質(zhì)纖維化相關(guān)基因(α-SMA、FN)的表達(dá)。如圖1A所示，低氧培養(yǎng)6 h(0.485±0.013，P=0.002)、12 h(0.507±0.003,P=0.004)、24 h(0.484±0.019,P=0.006)和48 h(0.071±0.001，P=0.001)miR-486的表達(dá)均低于與低氧培養(yǎng)0 h MRC5細(xì)胞miR-486的表達(dá)(1.000±0.044)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。研究還顯示低氧可以促進(jìn)MRC5細(xì)胞PF相關(guān)基因α-SMA和FN的表達(dá)，α-SMA和FN的表達(dá)在低氧培養(yǎng)24和48 h均明顯高于低氧培養(yǎng)0 h MRC5細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1B、C。

分別收集低氧培養(yǎng)0、24 和48 h MRC5細(xì)胞提取蛋白，蛋白提取后分別檢測p-SMAD2及GAPDH的表達(dá)，結(jié)果顯示，與常氧培養(yǎng)MRC5細(xì)胞比較，低氧培養(yǎng)24及48 h MRC5細(xì)胞p-SMAD2表達(dá)升高(圖1D)。

2.2 過表達(dá)或沉默miR-486對MRC5細(xì)胞miR-486的調(diào)控作用對MRC5細(xì)胞分別用慢病毒技術(shù)過表達(dá)及沉默miR-486，如圖2A所示，過表達(dá)miR-486 MRC5細(xì)胞中miR-486的表達(dá)水平明顯升高，而沉默miR-486 MRC5細(xì)胞中miR-486的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2B。

2.3 MiR-486對MRC5細(xì)胞α-SMA、FN、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的調(diào)控作用用慢病毒技術(shù)分別對MRC5細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)及沉默miR-486，檢測PF相關(guān)基因的表達(dá)情況。如圖3A所示，與轉(zhuǎn)染對照病毒MRC5細(xì)胞PF相關(guān)基因α-SMA(1.000±0.077)、FN(1.000±0.011)、Collagen Ⅰ(1.000±0.041)和Collagen Ⅲ(1.000±0.032)的表達(dá)比較，過表達(dá)miR-486 MRC5細(xì)胞α-SMA(0.066±0.009,P=0.004)、FN(0.032±0.015,P=0.000)、Collagen Ⅰ(0.714±0.012,P=0.006)和Collagen Ⅲ(0.317±0.092,P=0.011)的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而與轉(zhuǎn)染對照病毒MRC5細(xì)胞PF相關(guān)基因α-SMA(1.000±0.170)、FN(1.000±0.140)、Collagen Ⅰ(1.000±0.153)和Collagen Ⅲ(1.000±0.004)的表達(dá)比較，沉默miR-486 MRC5細(xì)胞α-SMA(17.129±1.150，P=0.002)、FN(3.416±0.221，P=0.006)、Collagen Ⅰ(6.694±0.247，P=0.000)和Collagen Ⅲ(3.526±0.119，P=0.000)表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3B。

A：miR-486的表達(dá)；B：FN的表達(dá)；C：α-SMA的表達(dá)；D：p-SMAD2的表達(dá)；與常氧培養(yǎng)MRC5細(xì)胞(0 h)比較：**P<0.01，***P<0.001

2.4 MiR-486調(diào)控MRC5細(xì)胞中p-SMAD2的表達(dá)用慢病毒技術(shù)分別對MRC5細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)及沉默miR-486，檢測MRC5細(xì)胞p-SMAD2蛋白的表達(dá)情況。如圖4所示，過表達(dá)miR-486可以抑制p-SMAD2的表達(dá)，而沉默miR-486促進(jìn)p-SMAD2的表達(dá)。

圖2 MRC5細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)及沉默miR-486慢病毒后miR-486的表達(dá)

A：MRC5細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-486慢病毒及對照病毒后miR-486的表達(dá)(1:對照組;2:miR-486過表達(dá)組)；B：MRC5細(xì)胞轉(zhuǎn)染沉默miR-486慢病毒及對照病毒后miR-486的表達(dá)(1:對照組;2:miR-486沉默組)；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 過表達(dá)或沉默miR-486 MRC5細(xì)胞FN、α-SMA、Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ的表達(dá)

A：轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-486慢病毒及對照病毒 MRC5細(xì)胞FN、α-SMA、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ的表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染沉默miR-486慢病毒及對照病毒MRC5細(xì)胞FN、α-SMA、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ的表達(dá)；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

PF是一系列疾病的共同結(jié)局，預(yù)后極差，其病變主要累及肺間質(zhì)，也可累及肺血管及肺泡上皮細(xì)胞[4-5]，研究[6]表明PF患者肺組織主要表現(xiàn)為過度肌成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白尤其是膠原蛋白沉積。目前認(rèn)為病灶中的成纖維細(xì)胞尤其是肌成纖維細(xì)胞是分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞[7]。因此，本研究以MRC5細(xì)胞為研究對象，探索低氧誘導(dǎo)的PF發(fā)病機(jī)制。

圖4 過表達(dá)或沉默miR-486 MRC5細(xì)胞p-SMAD2的表達(dá)

A：轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-486慢病毒及對照病毒MRC5細(xì)胞p-SMAD2的表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染沉默miR-486慢病毒及對照病毒MRC5細(xì)胞p-SMAD2的表達(dá)

關(guān)于PF的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確，細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積被認(rèn)為是纖維化的主要原因，其中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ以及纖連蛋白等是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。研究[8-9]表明低氧是一種潛在的促纖維化因素,其可能通過促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子1α (hypoxia-inducible 1α,HIF-1α)等的表達(dá)，同時發(fā)生肺泡上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致PF發(fā)生[10]，或通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積及纖維化因子的高表達(dá)[11]等病理改變,最終導(dǎo)致廣泛纖維化。本研究顯示低氧可以促進(jìn)FN及α-SMA的表達(dá)，這與前人研究一致[12]，并且研究還表明隨低氧處理時間的延長FN及α-SMA的表達(dá)逐漸升高，提示隨低氧時間延長PF將呈進(jìn)行性進(jìn)展，這進(jìn)一步明確了低氧參與了PF發(fā)病過程[12-13]。

低氧可以廣泛調(diào)節(jié)多種miRNAs的表達(dá)，這一類miRNAs被稱為低氧相關(guān)miRNAs[2]，其通過調(diào)控下游靶基因調(diào)控相應(yīng)信號通路，參與調(diào)節(jié)低氧相關(guān)的細(xì)胞代謝等生物學(xué)進(jìn)程。本研究涉及的miR-486基因位于Ank1基因，其在哺乳動物中高度保守，既往實驗[2]顯示其同樣為一種低氧相關(guān)的miRNA。因此本研究分別用慢病毒技術(shù)過表達(dá)或沉默技術(shù)對MRC5細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)或沉默，結(jié)果表明用慢病毒技術(shù)過表達(dá)miR-486可以明顯提高細(xì)胞MRC5 miR-486的表達(dá)，而沉默miR-486 MRC5細(xì)胞其miR-486的表達(dá)明顯降低，表明慢病毒技術(shù)可以良好的增加或者抑制MRC5細(xì)胞miR-486的表達(dá)。為明確miR-486在PF發(fā)病中的作用，本研究對MRC5細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)或沉默miR-486后進(jìn)行了PF相關(guān)基因的檢測，結(jié)果顯示將MRC5細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)miR-486后MRC5細(xì)胞PF相關(guān)基因FN、α-SMA、Collagen Ⅲ和Collagen Ⅰ表達(dá)降低，與之相反，沉默miR-486 后MRC5細(xì)胞FN、α-SMA、Collagen Ⅲ和Collagen Ⅰ表達(dá)升高，表明miR-486參與了調(diào)控PF發(fā)病的病理生理學(xué)過程。

SMAD2是纖維化疾病發(fā)病過程中的重要調(diào)節(jié)中介，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的的增殖、遷移、侵襲以及分化為肌成纖維細(xì)胞等病理生理學(xué)過程。有研究[14]表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor beta，TGF-β)可以通過調(diào)控SMAD2/SMAD3的磷酸化，與SMAD4形成異聚體復(fù)合物，該復(fù)合物轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核與DNA、轉(zhuǎn)錄因子等相互作用參與纖維化發(fā)病過程。因此，SMAD2在TGF-β信號通路中是關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及轉(zhuǎn)錄因子。此外，研究[4]表明SMAD2在小鼠胚肺成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞中為miR-486的靶基因，通過TargetScan靶基因預(yù)測同樣顯示SMAD2為miR-486的靶基因。本研究顯示低氧可促進(jìn)p-SMAD2的表達(dá)，并且隨低氧時間延長其表達(dá)呈逐漸增高趨勢。結(jié)果還顯示在MRC5細(xì)胞中過表達(dá)miR-486可以抑制p-SMAD2的表達(dá)，而沉默miR-486可以促進(jìn)p-SMAD2的表達(dá)。這表明在MRC5細(xì)胞中低氧可以通過調(diào)控miR-486進(jìn)而調(diào)控p-SMAD2的表達(dá)參與PF發(fā)病病理學(xué)過程。

綜上所述，本研究明確了低氧參與了PF的發(fā)病過程，并且發(fā)現(xiàn)低氧可通過抑制miR-486的表達(dá)激活SMAD2信號通路，加重PF進(jìn)展的病理生理過程，但本研究缺乏體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ鸵罁?jù)，下一步可通過體內(nèi)實驗明確過表達(dá)miR-486基因是否能達(dá)到緩解PF進(jìn)展的作用。