CYFIP1表達(dá)與肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

顧 炯, 崔 笑, 侯 輝, 喻宗繁, 張 彬, 熊奇如

與其他常見(jiàn)腫瘤相比，肝細(xì)胞性肝癌(hepatocarcinoma，HCC)惡性程度較高、易復(fù)發(fā)，而且治療方式有限，患者預(yù)后較差，生存期較短[1]。細(xì)胞信號(hào)通路如PI3K-AKT-mTOR、JAK-STAT、Wnt/β-catenin等[2]已被證實(shí)在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，腫瘤分子靶向治療也成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。針對(duì)HCC的分子靶向藥物如索拉非尼、樂(lè)伐替尼等在臨床治療中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用，但是分子靶向治療的效果不盡如人意，部分藥物治療后期耐藥率較高[3]。因此，需要對(duì)HCC發(fā)病的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，幫助發(fā)現(xiàn)更有效的靶向藥物或治療方法。

細(xì)胞內(nèi)mRNA翻譯通常有2種途徑：Cap-依賴(lài)型和非Cap-依賴(lài)型。Cap-依賴(lài)型mRNA翻譯異常與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。在Cap-依賴(lài)型mRNA翻譯進(jìn)程中，起始階段的調(diào)控作用尤其重要，主要參與的調(diào)控因子有：真核起始因子復(fù)合物4F (eukaryotic initiation factor 4F，EIF4F) 以及CYFIP1-EIF4E-FMR1復(fù)合物[5-6]。其中細(xì)胞質(zhì)FMR1相關(guān)蛋白1(cytoplasmic FMR1-interacting protein 1，CYFIP1)被證實(shí)是一些腫瘤如鼻咽癌、乳腺癌等的潛在抑制因子[4,7]，但是CYFIP1在HCC發(fā)病中的作用目前尚不清楚。故該研究主要探討CYFIP1的表達(dá)與HCC臨床特征之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標(biāo)本與病例資料 組織標(biāo)本取自安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的標(biāo)本庫(kù)，并制作成組織芯片。共納入4張組織芯片，包括80例HCC患者的腫瘤組織以及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織。80例患者均經(jīng)病理檢查證實(shí)為HCC，且在采集組織時(shí)，均未進(jìn)行除手術(shù)以外的任何抗腫瘤治療，如肝靜脈插管化療栓塞和灌注(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)等；同時(shí)收集納入患者的臨床資料以及隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)。隨訪(fǎng)截止日期為2019年4月1日。本研究符合安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑與儀器 超靈敏兩步免疫組織化學(xué)套盒PV-9001(北京中杉金橋)；Rabbit anti-CYFIP1多克隆抗體(ab156016，美國(guó)Abcam)；凋亡試劑盒Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I (556547, 美國(guó)BD)等。Western blot顯影儀(Tanon Fine-doX6, 上海)；精密恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher, 美國(guó))；酶標(biāo)儀(KHB ST-360, 美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 組織芯片厚度4 μm，封蠟室溫保存。按以下步驟行免疫組化染色：切片置于70 ℃溫箱中烤片1 h，于二甲苯中脫蠟2×3 min，接著分別用無(wú)水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇進(jìn)行梯度脫水處理；抗原修復(fù)采用高壓煮沸方式(枸櫞酸鈉緩沖液，3 min)；用3% H2O2進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷后，1% BSA封閉1 h；4 ℃冰箱中孵育一抗(1 ∶100)過(guò)夜；第2天常溫孵育二抗(1 ∶1 000)1 h后，進(jìn)行DAB染色，顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。免疫組化的結(jié)果由2位醫(yī)師分別進(jìn)行分級(jí)(1：最弱；4：最強(qiáng))。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 含10%血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基用于HepG2細(xì)胞。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。每3 d更換培養(yǎng)基1次。

1.2.3Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 6孔板中的細(xì)胞經(jīng)處理，并提取蛋白。蛋白濃度采用BCA試劑盒測(cè)定。電泳凝膠為10%～12% SDS聚丙烯酰胺凝膠。濃縮膠電泳條件為：80 V、30 min ；分離膠電泳條件為：120 V、60 min；轉(zhuǎn)膜條件為：200 mA恒定電流下1 h。5% BSA室溫封閉1 h；4 ℃過(guò)夜孵育一抗(1 ∶1 000)；室溫孵育二抗(1 ∶10 000)1 h。

1.2.4流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 6孔板中的細(xì)胞，離心后用1×緩沖液重懸并計(jì)數(shù)，將濃度稀釋為1×106個(gè)/ml。充分震蕩后，取100 μl細(xì)胞懸液加入流式管中，再用5 μl ANNEXIN V和5 μl PI進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件。分類(lèi)變量的數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)；臨床指標(biāo)與蛋白表達(dá)程度的相關(guān)性研究采用多因素方差分析；Log-rank test及Gehan-Breslow-Wilcoxon test用于生存曲線(xiàn)的差異性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYFIP1在腫瘤組織中的表達(dá)納入的80例HCC患者人口學(xué)特征和臨床基本情況見(jiàn)表1。組織芯片免疫組織化學(xué)染色情況見(jiàn)圖1。與癌旁組織比較，42例患者的腫瘤組織中存在CYFIP1低表達(dá)，20例患者組織中存在CYFIP1的高表達(dá)，另18例患者腫瘤組織中CYFIP1的表達(dá)未見(jiàn)差異。其中在42例低表達(dá)的患者中，腫瘤組織CYFIP1的表達(dá)量較癌旁正常組織中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。

圖1 CYFIP1組織芯片免疫組化表達(dá)情況 ×100

2.2 CYFIP1在腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤組織分化、腫瘤直徑及患者生存期的關(guān)系多因素分析的結(jié)果提示，CYFIP1的表達(dá)與患者的腫瘤分級(jí)、腫瘤直徑2項(xiàng)臨床指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012、P=0.014)；但是與性別、年齡、血清AFP、HBV-DNA、Child分級(jí)等指標(biāo)的關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。見(jiàn)表1。生存分析顯示CYFIP1低表達(dá)的患者生存期較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。見(jiàn)圖2A。

2.3 沉默CYFIP1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響在人肝癌細(xì)胞系HepG2中采用siRNA沉默CYFIP1后，Western blot驗(yàn)證siRNA沉默有效。與陰性對(duì)照組(negative control，NC)比較, siRNA沉默CYFIP1后，MTT結(jié)果提示其細(xì)胞增殖速度提高(P=0.019)。見(jiàn)圖2B。流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果提示，沉默CYFIP1后細(xì)胞中晚期凋亡比例降低(P=0.021)。見(jiàn)圖2C。

表1 CYFIP1表達(dá)情況與HCC患者臨床特征的相關(guān)性分析

3 討論

HCC是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一, 由于HCC的治療難度較大，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，因此針對(duì)HCC的分子生物學(xué)機(jī)制研究一直是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。CYFIP1作為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等腫瘤中具有一定的腫瘤抑制作用[6-7,8]，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]，但是CYFIP1在肝癌中的作用目前相關(guān)報(bào)道有限，因此本研究首次探討了CYFIP1的表達(dá)與HCC臨床特征的相關(guān)性。

本研究結(jié)果表明，CYFIP1是HCC的一個(gè)抑癌基因，其在HCC患者組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織。更重要的是，CYFIP1的表達(dá)與HCC患者的腫瘤生存期、腫瘤大小以及腫瘤分化程度具有相關(guān)性。這些結(jié)果提示，CYFIP1的表達(dá)可能與HCC的發(fā)生發(fā)展具有重要關(guān)聯(lián)，是潛在的治療靶點(diǎn)或臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)。同時(shí)，進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，HCC細(xì)胞敲低CYFIP1后，其細(xì)胞凋亡水平下降，增殖能力提升，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CYFIP1是HCC的潛在抑癌基因。

圖2 CYFIP1表達(dá)對(duì)HCC的發(fā)生發(fā)展的影響

A：CYFIP1表達(dá)與HCC患者的生存分析；B：沉默CYFIP1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響；C：沉默CYFIP1的表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

CYFIP1作為Scar/WAVE復(fù)合物的重要組成部分，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的形成。Scar/WAVE復(fù)合物通過(guò)其VCA結(jié)構(gòu)域來(lái)接受上游信號(hào)蛋白的調(diào)控[10]。也有研究[7,10]表明，下調(diào)腫瘤細(xì)胞中的CYFIP1可以引起WASF3的穩(wěn)定失調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲能力的增加。CYFIP1還可能與脆性X智力低下相關(guān)蛋白結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)mTOR功能相關(guān)的生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖和凋亡等[11]。除此之外，CYFIP1也可與EIF4E結(jié)合，進(jìn)一步抑制EFI4E:EIF4G復(fù)合物的形成，從而抑制CAP依賴(lài)型的mRNA翻譯，并且MNK也調(diào)節(jié)著CYFIP1/FMRP復(fù)合物[12]。本研究首次發(fā)現(xiàn)CYFIP1在HCC中的表達(dá)程度及其與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，提示CYFIP1可能是HCC的潛在預(yù)后指標(biāo)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。