miR-106a-5p靶向ERK2逆轉胃癌細胞MGC-803對順鉑化療的耐藥性

劉 耿，李永坤，劉洪鋒

胃癌是世界上最常見的癌癥之一，具有較高的發病率和死亡率，給社會造成巨大經濟負擔。而誘發胃癌的因素眾多，包括飲食、遺傳、幽門螺桿菌感染等，與年齡和性別也存在相關性，且由于前期隱匿性較強導致延誤治療[1]。目前，順鉑化療作為晚期胃癌的一線治療方案，在對患者的治療中體現出不同的治療效果，而這可能是由于癌組織中基因表達異常導致化療藥物耐藥性產生所造成的。有研究[2]顯示miRNA的異常表達可能是降低化療敏感性的重要原因。近年來，對miRNA的深入研究[3]顯示miRNA在腫瘤的發生發展中扮演著重要角色，可作為惡性腫瘤診斷和預后標志物。miR-106a-5p作為miR-17家族的一員，被報道調控多種腫瘤和癌癥發生發展，如：腎細胞癌[4]、骨肉瘤[5]、星形細胞瘤[6]等。已有相關研究顯示，miR-106a-5p前體miR-106a可以逆轉人腦膠質瘤細胞對順鉑和吉非替尼的耐藥性[7]。而細胞外調節蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK)，包括ERK1和ERK2，是調控細胞增殖分化、凋亡和癌變的關鍵因子。現通過研究miR-106a-5p對胃癌細胞中ERK2的表達以及對臨床胃癌順鉑化療的敏感性的影響，為臨床上癌癥的治療提供依據和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI 1640培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；人胃癌細胞系 MGC-803購自上海吉凱基因化學技術有限公司；順鉑(DDP)購自美國Hospira公司；TRIzol Reagent、TaqMan miRNA反轉錄試劑盒、TaqMan miRNA定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；反轉錄試劑盒、PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine? 2000試劑購自美國Invitrogen公司；EDU細胞增殖檢測試劑盒、hochest33342染料購自北京索萊寶公司；E-鈣黏蛋白(E-Cadherin，E-Cad)、N-鈣黏蛋白(N-Cadherin，N-Cad)、GAPDH抗體均購自美國CST公司。

1.2 細胞培養及耐藥株細胞的建立胃癌細胞MGC-803培養于含10% FBS的RPMI 1640培養基，放置于5% CO2、37 ℃的培養箱內，傳代3次后用于后續試驗。在胃癌細胞MGC-803生長到對數期時從低濃度DDP(0.5 mg/L)開始誘導細胞，每2 d更換培養液，去除死亡細胞后待細胞狀態穩定且再次達到對數生長期繼續傳代細胞，且增加25%的藥物濃度。持續誘導6個月后，以細胞能夠穩定的存活于含高濃度(5 mg/L)的DDP培養液中且可以連續傳代培養，無細胞的明顯死亡后說明順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP建立成功。耐藥細胞株MGC-803/DDP的培養方式與胃癌細胞MGC-803相同。

1.3 RT-PCR檢測將兩種細胞均以1×105個/孔培養于6孔板，待細胞貼壁，用PBS清洗細胞并提取總RNA，通過超微量核算蛋白測定儀測定濃度。用TaqMan miRNA反轉錄試劑盒或Takara反轉錄試劑盒合成cDNA。引物序列如下：miR-106a-5p正向：5′-GATGCTCAAAAAGTGCTTA CAGTGCA-3′；miR-106a-5p反向：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；ERK2正向：5′-AGGCTGTTCCCAAATGCT-3′；ERK2反向：5′-CGTCACTCGGGTCGTAAT-3′。miR-106a-5p PCR 擴增條件：預變性 95 ℃、10 s，變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、20 s，40個循環。ERK2擴增條件：預變性94 ℃、10 s，變性45 s，退火59 ℃、45 s，35個循環，結果采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.4 細胞轉染將MGC-803/DDP細胞以1×105個/孔的密度培養于6孔板，待其生長密度達到50%時才可用于轉染。操作步驟按照轉染試劑盒執行即可，轉染8 h后將培養液更換為含10% FBS的RPMI 1640培養基進行培養，48 h后用于后續試驗。

1.5 熒光素酶報告基因檢測應用生物信息學軟件PicTar、Targetscan數據庫對miR-106a-5p可能的靶基因進行預測。構建ERK2野生型(WT)和突變型(MUT)pGL3-熒光素酶報告載體。將耐藥細胞株MGC-803/DDP細胞分為WT組、MUT組、WT+miR-106a-5p mimics組和MUT+miR-106a-5p mimics組，培養于24孔板，每組3個復孔，按分組情況分別進行轉染，48 h后通過熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。

1.6 MTT檢測細胞活性將ERK2構建到pcDNA3.1質粒，轉染空載質粒和pc-ERK2至耐藥細胞株MGC-803/DDP中，48 h后通過RT-PCR檢測ERK2表達情況，確認過表達成功。分別轉染miR-106a-5p mimic和pc-ERK2至耐藥細胞株MGC-803/DDP，并分為Control(對照)組、mimic NC(陰性對照)組、miR-106a-5p mimic (miR-106a-5p高表達) 組、ERK2(ERK2高表達)組和mimic+ERK2(共轉染)組。將轉染后細胞以5×103個/孔的密度培養于96孔板，各組6個復孔。加入20 μmol/L 的DDP 5 μl處理細胞24 h，每孔加入10 μl MTT溶液，繼續孵育4 h。各孔加入100 μl Formanzan溶解液，孵育至紫色結晶會全部溶解。在570 nm測定吸光度。

1.7 EdU染色轉染后各組細胞中加入20 μmol/L 的DDP 5 μl處理24 h，后續步驟按照EDU細胞增殖檢測試劑盒操作說明進行。每孔加入50 μmol/L EdU 100 μl至培養基孵育2 h，PBS清洗細胞，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，棄去固定液；每孔加入甘氨酸中和固定液，PBS清洗；每孔加入100 μl滲透劑后孵育10 min；PBS清洗；每孔加入100 μl的1×Apollo染色液，孵育30 min，棄去染色反應液；加入100 μl 0.5% Triton X-100清洗2～3次；每孔加入100 μl甲醇清洗后再PBS清洗。每孔加入100 μl 1× Hoechst 33342反應液，孵育30 min后，PBS清洗；圖像獲取及分析。

1.8 Hochest33342染色檢測細胞凋亡將MGC-803/DDP細胞培養于有細胞爬片的6孔板，分組同上。分別將miR-106a mimics和pc-ERK2按分組轉染至MGC-803/DDP細胞，48 h后換液，除對照組外均加入DDP處理24 h。各孔棄去培養液，PBS清洗細胞3次，加入hochest33342染液，于保溫箱中孵育30 min后棄去染液，PBS清洗3次，滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片。激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右，熒光顯微鏡下檢測拍照。

1.9 Transwell檢測細胞侵襲將各轉染組胃癌細胞以1×105/ml密度，接種200 μl于鋪有Matrigel基質膠的Transwell小室上室，下室加入600 μl含20% FBS的RPMI 1640培養基。37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后，用棉簽擦去基質膠和上室未穿膜細胞，甲醇固定10 min，Giemsa染色30 min，鏡下隨機5個視野(1×100) 觀察結果并拍照、計數，取均值。

1.10 Western blot檢測將各轉染組胃癌細胞以1×105個/孔培養于6孔板，細胞貼壁后，DDP 處理24 h，用PBS清洗細胞，用含有PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度后，經10% SDS-PAGE凝膠電泳進行電泳，分別孵育相應的一抗、二抗，加入BCL，進行曝光。

2 結果

2.1 miR-106a-5p和ERK2在兩種細胞系中表達量的差異通過RT-PCR檢測miR-106a-5p和ERK2在胃癌細胞株MGC-803和順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP中的表達差異。如圖1所示，以胃癌細胞株MGC-803為對照組，miR-106a-5p在順鉑耐藥細胞株中的表達降低(t=10.31，P<0.05)，而ERK2 mRNA的表達上升(t=8.95，P<0.05)。由此可見，miR-106a-5p、ERK2在胃癌細胞株MGC-803和順鉑耐藥細胞株中的表達量呈相反趨勢。

A：兩種細胞系中miR-106a-5p表達量；B：兩種細胞系中ERK1表達量；與MGC803比較:*P<0.05

2.2 miR-106a-5p靶向下調ERK2基因將miR-106a-5p轉染到MGC-803/DDP細胞，通過RT-PCR檢測miR-106a-5p的表達量。與對照組相比，miR-106a-5p mimic轉染組中miR-106a-5p的表達量升高(t=21.14，P<0.05)，見圖2A。生物學預測miR-106a-5p與ERK2的靶向關系。ERK2基因序列上存在miR-106a-5p的結合位點，見圖2B。通過熒光素酶報告基因試驗進一步證實miR-106a-5p與ERK2的靶向關系。miR-106a-5p靶向下調ERK2的表達(t=5.38，P<0.05),見圖2C。由此可見，miR-106a-5p靶向作用于ERK2基因，且下調ERK2的表達量。

2.3 miR-106a-5p過表達逆轉ERK2誘導的胃癌細胞活性增強與增殖將pc-ERK2轉染到MGC-803/DDP細胞，通過RT-PCR確認ERK2的過表達。ERK2組中ERK2的表達量高于對照組(t=18.22，P<0.05)，見圖3A。將miR-106a-5p mimic和pc-ERK2分別轉染到MGC-803/DDP細胞，經20 μmol/L DDP處理后通過MTT法檢測細胞活力。與對照組相比，miR-106a-5p mimic組的細胞活力下降(t=25.37，P<0.05)，而ERK2組細胞活力上升(t=9.32，P<0.05)，見圖3B。與ERK2組相比，mimci+ERK2組的活力下降(t=4.82，P<0.05)。通過EDU染色檢測各組細胞增殖情況。與對照組(42±14)相比，miR-106a-5p mimic組(12±8)的細胞增殖數量下降(t=7.86，P<0.05)，而ERK2組(75±17)細胞增殖數量上升(t=13.66，P<0.05)。與ERK2組相比，mimic+ERK2組(51±12)細胞增殖數量下降(t=4.26，P<0.05)，見圖3C。由此可見，ERK2的高表達可以提高MGC-803/DDP細胞在順鉑作用下的細胞活性并誘導其增殖，而miR-106a-5p的高表達則可以逆轉ERK2高表達帶來的影響。

圖2 miR-106a-5p與ERK2基因的靶向關系

A：miR-106a-5p轉染效果；1：Control組；2：mimic NC組；3：miR-106a-5p mimic組；B：miR-106a-5p與ERK2基因靶向序列預測；C：熒光素酶報告實驗檢測靶向關系；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2 wt組比較：#P<0.05

2.4 miR-106a-5p過表達逆轉ERK2誘導的MGC-803/DDP細胞凋亡減少通過hochest33342染色檢測各組MGC-803/DDP細胞凋亡情況。與對照組(3.9±2.0)相比，miR-106a-5p mimic組(42.4±6.8)細胞凋亡數量升高(t=17.02，P<0.05)，而ERK2組(2.0±1.7)細胞凋亡數量減少(t=15.85，P<0.05)。見圖4。與ERK2組相比，mimic+ERK2組(10.2±4.2)中細胞凋亡數量上升(t=8.80，P<0.05)。由此可見，miR-106a-5p過表達可逆轉ERK2過表達誘導的MGC-803/DDP細胞凋亡水平降低。

圖3 MTT法和EDU染色法檢測胃癌細胞MGC-803/DDP的活力與增殖情況

A：pc-ERK2轉染效率；1：Control組；2：Vector組；3：ERK2組；B：MTT檢測不同濃度DDP處理下MGC-803/DDP細胞活力；C：EdU檢測MGC-803/DDP細胞增殖 ×400 ；1：Control組；2：mimic組；3：ERK2組；4：mimic+ERK2組；D：EdU+陽性細胞率；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2組比較：#P<0.05

圖4 Hochest33342染色法檢測MGC-803/DDP細胞的凋亡情況

A：Hochest33342檢測細胞凋亡 ×400；1：Control組；2：mimic組:3：ERK2組；4：mimic+ERK2組；B：MGC-803/DDP細胞凋亡百分率；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2組比較：#P<0.05

2.5 miR-106a-5p過表達逆轉ERK2誘導的MGC-803/DDP細胞侵襲力增強通過Transwell檢測各組MGC-803/DDP細胞侵襲力的改變。如圖5所示，與對照組(63±19)相比，miR-106a-5p mimic組(10±7)中細胞侵襲數量下降(t=9.09，P<0.05)，而ERK2組(159±39)中的細胞侵襲數量上升(t=15.49，P<0.05)。與ERK2轉染組相比，mimci+ERK2組(54±16)細胞侵襲數量下降(t=11.24，P<0.05)。由此可見，miR-106a-5p過表達逆轉了ERK2誘導的MGC-803/DDP細胞侵襲數量增加。

圖5 Transwell檢測MGC-803/DDP細胞的侵襲力

A：Transwell檢測細胞侵襲 ×400；1：Control組；2：mimic組；3：ERK2組；4：mimic+ERK2組；B：MGC-803/DDP細胞侵襲數量；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2組比較：#P<0.05

2.6 miR-106a-5p過表達逆轉ERK2對EMT標志性蛋白表達量的影響通過Western blot檢測各組細胞中E-cad、N-cad蛋白的表達情況。如圖6A所示，與對照組相比，miR-106a-5p mimic組中E-cad表達量上升(t=9.45，P<0.05)，N-cad的表達量下降(t=13.24，P<0.05)；而ERK2組中E-cad表達量較對照組下降(t=24.88，P<0.05)，N-cad表達量上升(t=30.22，P<0.05)。與ERK2組相比，mimci+ERK2組中E-cad表達量上升(t=18.42，P<0.05)，而N-cad表達量下降(t=15.43，P<0.05)。由此可見，miR-106a-5p過表達可逆轉ERK2過表達對上皮細胞-間充質轉化中標志性蛋白表達量的影響。

圖6 Western blot檢測MGC-803/DDP細胞中E-cad、N-cad的蛋白表達量

A：Western blot檢測細胞E-cad蛋白表達量；B：Western blot檢測細胞N-cad蛋白表達量；1：Control組；2：mimic組；3：ERK2組；4：mimic+ERK2組；與Control組比較：*P<0.05；與ERK2組比較：#P<0.05

3 討論

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤疾病，目前臨床上對于胃癌的治療方案主要是采用鉑類化療藥物進行治療[8]。但是隨著化療次數的增多，腫瘤細胞會對鉑類化療藥物(包括順鉑)產生耐藥性，而腫瘤細胞對鉑類藥物產生耐藥性的機制較為復雜，如靶點異常表達、藥物作用通路抑制、癌細胞對藥物的外排增強、DNA修復能力增強等。因此，逆轉順鉑的耐藥性將成為提高癌癥化療效果的關鍵。

ERK包括ERK1和ERK2，是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵，磷酸化激活的ERK1/2由胞質轉位到核內，進而參與細胞增殖與分化、細胞形態維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞的癌變等多種生物學反應，其中ERK2即MAPK1。miR-106a-5p是miR-106a 的剪切成熟體，參與著對基因表達的調控。近年來大量研究證實ERK在癌癥的發生發展中扮演著重要的角色。李登舉 等[9]發現，ERK信號轉導途徑的抑制導致磷酸化ERK1和ERK 2蛋白質低表達，并連續下調端粒酶活性，最終提高卵巢癌細胞COC1/DDP對DDP的敏感性。除此之外，Ye et al[10]發現，鼻咽癌患者血清或NPC細胞中miR-106a-5p過表達，且參與下調MARK1信號傳導途徑活性以改變細胞增殖和分化。因此推測，miR-106a-5p可以下調ERK2的表達，進而逆轉MGC-803/DDP細胞對順鉑的耐藥性。

為了證實我們推測，我們通過RT-PCR檢測了miR-106a-5p和ERK2在胃癌細胞株MGC-803和順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP中的表達情況。結果顯示，106a-5p和ERK2在胃癌細胞株MGC-803和順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP中的表達量均在負相關性。為了進一步確定miR-106a-5p和ERK2存在靶向關系，本研究通過軟件分析預測了miR-106a-5p和ERK2存在的作用關系，并通過熒光素酶報告基因檢測確定了miR-106a-5p和ERK2存在靶向關系。

為了探明miR-106a-5p和ERK2在胃癌細胞耐藥性中的相互關系，本研究進一步將miR-106a-5p mimic和pc-ERK2分別轉染至順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP中，并將DDP作用于實驗組中各組細胞，檢測各組細胞活性、增殖能力、凋亡水平以及侵襲能力的改變。研究結果顯示，miR-106a-5p可以靶向ERK2，降低DDP作用下順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP細胞活性，并誘導其凋亡水平的升高，同時降低其增殖能力和侵襲能力。研究結果表明，miR-106a-5p可以靶向ERK2，逆轉順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP細胞對DDP的耐藥性。

在多種癌癥的發生發展中，上皮細胞失去細胞極性和與基底膜連接的粘附作用進而轉化為具有間質表型的細胞的過程稱為上皮細胞-間充質轉化(EMT)。大量研究顯示，EMT的過度活化在上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞中起著增強癌細胞的遷移、侵襲能力的關鍵作用[11]。細胞黏附因子E-cad表達下調, 而N-cad表達上調是EMT過程中的標志性特征[12-14]。有相關研究顯示，ERK的磷酸化和EMT的激活有助于增強卵巢癌細胞SKOV-3對DDP的抗性，而ERK的抑制劑PDK8059可以逆轉其耐藥性的產生[15]。本研究結果顯示，miR-106a-5p可以抑制ERK2誘導的E-cad低表達及N-cad的高表達，這表明，miR-106a-5p可以靶向ERK2而抑制EMT過程，降低胃癌細胞的遷移、侵襲能力。

綜上所述，miR-106a-5p可以靶向抑制ERK2基因的表達，降低DDP作用下順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP細胞活性，并誘導其凋亡水平的升高，同時降低其增殖能力和侵襲能力，逆轉EMT過程，最終實現逆轉順鉑耐藥細胞株MGC-803/DDP細胞對DDP的耐藥性。目前，關于 miRNA 在胃癌耐藥中的研究多見于細胞株，而其對胃癌患者化療耐藥的影響研究仍較少，因此后期我們將通過建立胃癌模型大鼠，觀察miR-106a-5p對大鼠順鉑化療效果的影響。