中藥干預下脾虛痰濁動脈粥樣硬化巴馬豬小腸差異蛋白組學及生物信息學分析

王 佳，賈連群，宋 囡，馬藝鑫，張立德，張 哲，張會永，楊關林

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是引起血管損傷和心血管疾病的多因素過程，是世界范圍內引發死亡的主要原因，在形成早期，會發生內皮功能障礙，全身的血管緊張素損傷內皮細胞在AS的發病機制中扮演著關鍵角色。AS的病理基礎為脂質代謝障礙，而脂代謝主要在小腸進行，小腸的功能異常會成為引發AS的高危因素。流行病學研究[1]表明飲食習慣可能通過調節細胞脂質代謝、血管和內皮功能、炎癥因子反應等影響心血管疾病的發病率和治療效果。中醫脾的功能主要對應著消化吸收和能量代謝2個方面，巴馬小型豬的動脈硬化模型與人模型相近，故選取其作為實驗動物[2]。應用iTRAQ技術探討代表蛋白，GO富集分析及KEGG通路分析尋找關聯通路，部分地闡明中藥干預下脾虛痰濁AS巴馬豬小腸蛋白質組學變化機制，為蛋白質的改變影響提供實驗依據，為臨床治療脾虛痰濁AS疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組SPF級半歲(6～8個月)雄性廣西巴馬小型豬10只，體質量(29.88±2.27)kg，腸道菌群正常，單籠飼養，許可證號SCXK(蘇)2011-0002，購自泰州泰和生物科技有限公司。實驗室溫度為(20.80±2.97)℃，濕度(47.30±15.31)%[3]。委托遼寧中醫藥大學實驗動物中心飼養，自由攝食與飲水。隨機均分為模型組、中藥治療組。

1.2 試劑與儀器iTRAQ試劑(Applied Biosystems，北京)；ARF3抗體(博奧森，北京)，ATP5E抗體(博奧森，北京)；F3型全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統(Syngene，美國)；β-actin多克隆抗體(Abcam，美國)；垂直電泳裝置(Bio-Rad，美國)；HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天，北京)；Trans-Blot SD半干轉膜儀(Bio-Rad，美國)；化學發光底物(Thermo，美國)；MALDI-TOF/TOF質譜儀(Thermo fisher，美國)；蛋白酶抑制劑PMSF(Genview分裝，美國)；強陽離子交換柱(SCX，美國Phenomenex公司)；酶標儀(Thermo，美國)；BSA蛋白定量測定試劑盒(鼎國昌盛，北京)；HPLC(SHIMADZU，美國)；F3型全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統(Syngene，美國)。

1.3 模型制備及分組模型組詳見課題組相關文獻[4-5]。模型組采用中醫經典復合因素造模法，飲食不節加勞倦過度造脾虛模型，配合現代醫學冠脈內皮損傷手術造動脈粥樣硬化模型。模型組與中藥治療組高脂喂飼，中藥治療組第25周使用課題組臨床專利方健脾祛痰化瘀方藥攪拌于飼料中喂食。48周末，開腹取小腸組織。

1.4 iTRAQ定量分析(華大基因，深圳)

1.4.1蛋白質提取過程 同課題組共同取材制作，詳述如下[3]：稱取適量實驗動物小腸組織，使用蛋白裂解液溶解，超聲破碎組織15 min，25 000 r/min離心20 min，取上清液，加5倍丙酮，-20 ℃沉淀2 h后16 000 r/min離心20 min，棄上清液。取沉淀使用蛋白裂解液溶解，滴加2 mmol/L的EDTA、1 mmol/L的PMSF，5 min，滴加10 mmol/L的DTT，超聲15 min后16 000 r/min離心20 min，取上清液，加入10 mmol/L DTT處理1 h，56 ℃下操作。滴加MIAM試劑55 ml靜置45 min，暗室操作，封閉半胱氨酸的烷基化，滴加冷丙酮，條件-20 ℃靜置，2 h后25 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀在200 μl 0.5 mol/L TEAB中超聲溶解15 min，25 000 r/min離心20 min后取上清液定量[3]。

1.4.2蛋白質濃度測量 采用Bradford蛋白定量試劑盒，使用酶標儀測量595 nm的吸光度，由標準曲線判斷樣品濃度。

1.4.3SDS凝膠電泳 配置SDS聚丙烯酰胺凝膠，12%濃度。各樣品與4×loading buffer分別充分混合，95 ℃下加熱5 min。個體上樣量30 μg，標記上樣量10 μg。120 V恒壓電泳120 min，考馬斯亮藍染色2 h，脫色5次，30 min/次[3]。

1.4.4液質聯用分析 完成以上蛋白酶解、iTRAQ標記、SCX分離步驟，應用串聯ESI質譜儀分析經過液相分離的肽段。

1.4.5數據庫查詢 應用質譜儀對數據進行峰識別得出峰列表。應用Mascot 2.3.02軟件在蛋白質數據庫中進行肽段及蛋白質的鑒定，比較樣品之間蛋白的相對含量，獲取有意義的蛋白。

1.4.6生物信息學分析 按照蛋白質數據庫的使用標準，相對定量下，如同一蛋白量在樣品間無顯著變化，蛋白豐度比約為1。由此推斷，若蛋白豐度比即差異倍數達到1.2倍或以上，且P<0.05時，可以認為該蛋白為差異蛋白。應用GO數據庫(http://www.geneontology.org/)將差異蛋白質向的各個隊組映射，計算每個隊組的蛋白質數目，經幾何檢驗后可比對所有蛋白質背景進而得出差異蛋白質中顯著富集的GO條目。應用KEGG為單位(sourcel:http://www.genome.jp/ KEGG / pathway.htmll)進行富集分析，進行Pathway 顯著富集方法同上述的GO功能富集分析，可以確定差異蛋白參與的最重要的生化代謝途徑和信號轉導途徑[3]。

1.5 統計學處理本文主要關注了富集的脂質代謝、能量代謝等生物過程的蛋白變化，蛋白總體水平變化最顯著蛋白具體信息和功能會在后續研究中重點關注，本部分未比較血脂數據等數值信息，使用數據庫查詢及生物信息學分析方法可以完成本論文討論。

2 結果

2.1 蛋白定量分析以蛋白質豐度比即差異倍數達在1.2倍以上(P<0.05)，作為差異蛋白的判斷標準。圖1中展示3次重復蛋白定量均值分布，差異倍數經過以2為底數的對數轉化后的值作為橫坐標，大于0的代表表達量上調(紅色)，小于0的代表表達量下調(綠色)。本次蛋白定量結果治療組與模型組相比，分別得到上調差異蛋白70個、下調差異蛋白119個，總差異蛋白189個。見圖1。

2.2 差異蛋白GO富集分析對189個差異蛋白進行GO富集分析發現，這些差異蛋白主要富集到綁定、催化活性、運輸活性、結構分子活性等生物過程；細胞、細胞組分、細胞器、細胞膜、胞外區等細胞成分以及細胞過程、生物調節、生物過程調節、代謝過程、刺激應答、定位等分子功能。見圖2。

2.3 差異蛋白KEGG富集分析對189個差異蛋白進行KEGG通路分析發現，細胞黏附分子(圖3)通路變化最為顯著，吞噬體、突出囊泡循環、氨基酸生物合成、胰島素分泌、PPAR信號通路以及與脂代謝密切相關的脂肪消化和吸收(圖4)、膽汁酸分泌(圖5)通路顯著變化。此外，與能量代謝密切相關的氧化磷酸化(圖6)等通路蛋白亦發生改變。見圖7。

圖4 脂肪消化與吸收通路圖

圖5 膽汁酸代謝通路圖

圖7 治療組/模型組KEGG富集分析圖

3 討論

AS的重要病理基礎為脂質代謝障礙，而脂質代謝主要在小腸進行，小腸的消化吸收功能失常致使體內脂質代謝障礙，動脈內膜脂糖積聚、出血甚或形成血栓，進而出現纖維組織增生、鈣質沉著，兼有動脈中層漸進性蛻變、鈣化，最終動脈壁增厚變硬失去彈性、血管腔逐漸狹窄[6]。從中醫角度，以上病理狀態為痰證和瘀證，是AS中最具有典型性的兩個綜合征類型，課題組使用中醫經典復合造模方法，造成痰瘀互結狀態AS經典模型。

AS的病理機制已經明確，一些針對性治療AS的藥物作用，例如雷帕霉素抑制劑抗動脈粥樣硬化作用、小檗堿改善高脂飲食引起的AS、以及通過多種藥物調控巨噬細胞免疫代謝作用進而改善AS等，被廣泛研究。從中醫角度看，AS是氣虛在前，氣虛不能運血，血液淤滯；血水同源，血脈不行，痰濕不能運化，虛實夾雜，痰淤互見，因此益氣活血化痰是治療AS的主要治法[7]。中醫藥治療AS從“痰瘀同治”、“痰瘀相關”角度出發已經獲得公認[8]。遼寧中醫藥大學附屬醫院臨床驗方健脾祛痰化瘀方對模型組動物療效作用靶點需要確認。iTRAQ技術可以把握差異表達蛋白的動態變化，它的“整體”“動態”與中醫學的“整體觀”及“辨證論治”相契合，因而逐漸成為中醫認識疾病本質的重要手段。

根據上文結果，差異蛋白中，纖維蛋白原與AS炎癥模式和促炎細胞因子形成具有相關性，與內皮炎癥與血栓形成等密切相關[9-10]；還有一些與甘油脂類代謝、膽汁酸分泌等過程密切相關的關鍵酶，如胰脂肪酶等與AS直接或間接相關[11]。高脂肪和熱量的攝入容易導致心血管疾病、動脈硬化和結腸癌，通過藥物或者食物干預胰脂肪酶等的活性可能成為治療超重和肥胖甚至高脂狀態的新途徑[12-13]。炎癥通路與 AS 關系密切，眾多炎性細胞因子、趨化因子及黏附因子等相互作用，成倍速度擴大炎癥反應級聯，導致AS病變程度不斷加深，“炎癥學說”、“損傷-反應學說”成為目前AS 發病機制的主流學說。細胞黏附分子通路、泛素-蛋白酶體通路、轉化因子通路等與AS進程相關[14]。細胞過程、脂肪代謝過程和免疫刺激應答等相關功能，與AS病理過程密切相關，影響炎癥和血栓形成[15]。

本研究結果表明，臨床驗方健脾祛痰化瘀方干預下脾虛痰濁AS巴馬豬小腸差異蛋白組學改變可能與細胞炎癥反應、甘油脂類代謝、膽汁酸分泌等密切相關，脾虛高脂狀態小腸消化吸收功能異常，細胞炎癥反應可能與AS形成密切相關，健脾祛痰化瘀方治療靶點作用于炎癥通路、膽汁酸及脂肪代謝通路等，從蛋白質分子水平治療AS。