基于RNA-seq技術(shù)對(duì)重度子癇前期孕婦胎盤(pán)組織差異性表達(dá)circRNA的研究

周芝熠，李曉娟，蔣國(guó)慶，錢(qián) 源

子癇前期(preeclampsia,PE)是以新發(fā)高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)、 全身小動(dòng)脈痙攣為主要病理特點(diǎn)的妊娠期特有疾病，可導(dǎo)致母嬰死亡率和發(fā)病率增加，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已有的研究[1]表明是多種因素共同作用的結(jié)果。其中，胎盤(pán)異常在PE發(fā)病機(jī)制中起重要作用這一觀點(diǎn)已被普遍接受。胎盤(pán)具有物質(zhì)合成、交換、代謝以及防御功能，在維持妊娠過(guò)程發(fā)揮著重要作用。當(dāng)胎盤(pán)功能出現(xiàn)異常時(shí)，如螺旋動(dòng)脈血管重鑄不足引起的胎盤(pán)“淺著床”；或胎盤(pán)源性生理物質(zhì)分泌調(diào)節(jié)異常，引起新陳代謝、炎性反應(yīng)、血管生成的調(diào)控失調(diào)等，都可促使PE的發(fā)生[2]。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一種特殊類型的非編碼RNA，廣泛存在于生物體。不同于傳統(tǒng)的線性RNA，circRNA來(lái)源于 “反向剪接”過(guò)程，形成了既不具有極性也不具有多聚腺苷酸尾的從5'到3'端的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)[3]，這使得它比線性RNA更穩(wěn)定。circRNA在不同個(gè)體具有高度的組織特異性、細(xì)胞特異性，并有穩(wěn)定的表達(dá)水平。此外，除少數(shù)circRNA外，其中大多數(shù)在物種之間具有高度保守的序列[4]。這些特征使circRNA的異常表達(dá)有潛在的介導(dǎo)某些特殊疾病發(fā)生的可能性。circRNA可能通過(guò)以下5種方式發(fā)揮其生物學(xué)功能：miRNA海綿、作為翻譯模板、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、與RNA結(jié)合蛋白作用、螯合蛋白質(zhì)[4-5]。circRNA與人類多種疾病的發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系，但有關(guān)circRNA對(duì)PE作用的研究較少。因此，該研究檢測(cè)了sPE胎盤(pán)circRNA的表達(dá)水平并預(yù)測(cè)了這些circRNA的靶miRNA，想由此提供一種新的研究PE發(fā)病機(jī)制和檢測(cè)手段的途徑。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究納入的6例胎盤(pán)組織來(lái)自于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院分娩的單胎初產(chǎn)婦，其中sPE患者3例(實(shí)驗(yàn)組)；正常妊娠婦女3例(對(duì)照組)。sPE組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合sPE診斷標(biāo)準(zhǔn)：sPE定義為輕度PE和一個(gè)或多個(gè)以下其他不良特征的綜合：① 收縮壓≥21.33 kPa和(或)舒張壓≥14.67 kPa；② 蛋白尿≥5 g/24 h或隨機(jī)蛋白尿()；③ 其他臨床上的妊娠綜合征(包括腦神經(jīng)癥狀、乳酸脫氫酶>600 IU/U,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶>70 IU/U，血小板數(shù)量<100×109個(gè)細(xì)胞/L等)。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合正常妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn)：① 妊娠經(jīng)過(guò)順利；② 血壓<18.67/12 kPa；③ 無(wú)蛋白尿。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并心血管疾病、肝腎疾病、糖尿病、急慢性感染性疾病及胎兒染色體異?；虬l(fā)育畸形等妊娠合并癥病史。每位患者被告知胎盤(pán)用途，并簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 順產(chǎn)胎盤(pán)娩出后，在胎盤(pán)母體面和胎兒面無(wú)鈣化區(qū)和出血點(diǎn)的部位采集數(shù)塊面積約1 cm×1 cm×1 cm的胎盤(pán)組織，并在生理鹽水中反復(fù)漂洗去除血污，干紗布吸除水分后加入RNA later -80 ℃的冰箱保存，準(zhǔn)備進(jìn)行組織中的RNA提取。

1.2.2circRNA-seq檢測(cè) 按TRIzoI說(shuō)明書(shū)提取胎盤(pán)組織總RNA。采用RNA完整性和純度檢測(cè)合格的RNA，通過(guò)去除rRNA，合成雙鏈DNA，末端修復(fù)、連接測(cè)序接頭，片段選擇、降解第二鏈cDNA，PCR富集、文庫(kù)質(zhì)檢等過(guò)程，再對(duì)富集的 cDNA 進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)測(cè)序質(zhì)量合格的circRNA進(jìn)行鑒定，將測(cè)序序列數(shù)目(read count)≥2的候選 circRNA 作為鑒定的 circRNA。接著對(duì)候選circRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，circRNA差異表達(dá)的輸入數(shù)據(jù)為circRNA表達(dá)水平分析中得到的readcount數(shù)據(jù)。從差異倍數(shù)和校正后的顯著水平兩個(gè)水平進(jìn)行評(píng)估，對(duì)差異circRNA進(jìn)行篩選。

1.2.3靶基因預(yù)測(cè) 利用miRanda軟件對(duì)篩選獲得的差異性circRNA進(jìn)行下游miRNA預(yù)測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Illumina Casava 1.8版本測(cè)序平臺(tái)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序，使用 find_circ軟件鑒定circRNA和TPM進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理，用DEGseq進(jìn)行circRNA差異分析。差異circRNA篩選默認(rèn)篩選條件為：qvalue<0.01 && |log2(foldchange)|>1。

2 結(jié)果

2.1 circRNA在子癇前期患者胎盤(pán)中的表達(dá)情況共檢測(cè)出12 000個(gè)circRNA，其中有3 007個(gè)在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中均有表達(dá)(圖1)。比較這3 007個(gè)circRNA，發(fā)現(xiàn)89個(gè)差異性表達(dá)的circRNA，其中上調(diào)的circRNA有44個(gè)，下調(diào)的circRNA有45個(gè)(圖2)。上調(diào)和下調(diào)的circRNA差異倍數(shù)在5倍以上的分別為4個(gè)、10個(gè)。表1列出了上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)最明顯的十個(gè)基因的基本信息。

圖1 circRNA的維恩圖

圖2 差異性表達(dá)circRNA聚類圖

紅色代表上調(diào)基因；藍(lán)色代表下調(diào)基因；C：對(duì)照組；P：實(shí)驗(yàn)組

表1 上調(diào)/下調(diào)倍數(shù)前十的差異性表達(dá)circRNA

2.2 circRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果在篩選出的89個(gè)circRNA中，發(fā)現(xiàn)有75個(gè)circRNA具有has-let-7家族成員的結(jié)合位點(diǎn)，與miR-100、miR-101、miR-103家族成員有結(jié)合位點(diǎn)的circRNA個(gè)數(shù)分別是49、53和65個(gè)。與這4種miRNA均有合位點(diǎn)的circRNA有40個(gè)。其中，hsa_circ_0004383、hsa_circ_0000294、hsa_circ_0000645、hsa_circ_0010783、hsa_circ_0011179、hsa_circ_0011828、hsa_circ_0011962這七個(gè)差異性表達(dá)在5倍以上的circRNA與這四種miRNA皆有結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。

圖3 差異性表達(dá)在5倍以上的circRNA與其靶miRNA的網(wǎng)絡(luò)圖

紅色(圓形)：circRNA；黃色(三角形)：miRNA

3 討論

PE是孕產(chǎn)婦常見(jiàn)的特有疾病，嚴(yán)重威脅母嬰健康，目前缺乏精準(zhǔn)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，因此，深入研究PE的發(fā)病機(jī)制，找到能實(shí)現(xiàn)早期診斷及有效治療的分子靶標(biāo)有著重要意義。CircRNA的報(bào)道[4]從1990年代初開(kāi)始，由于技術(shù)水平的制約，近幾年才成為研究熱點(diǎn)。CircRNA可通過(guò)多種方式發(fā)揮其生物學(xué)功能，而了解較全面的是其能夠作為 miRNA 海綿競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA，從而參與疾病的發(fā)病機(jī)制中。有研究小組提出并驗(yàn)證了心臟相關(guān)的circRNA可作為內(nèi)源性miR-223海綿來(lái)抑制miR-223活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大與凋亡，或作為miR-7a海綿，通過(guò)降低miR-7a的活性和提高miR-7a靶標(biāo)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)心肌梗死的發(fā)展,從而參與心血管疾病的發(fā)生[5-6]。Wang et al[7]發(fā)現(xiàn)circRNA可抑制miR-7導(dǎo)致其不能誘導(dǎo)任何胰腺β細(xì)胞增殖，從而引起糖尿病發(fā)生。此外，circRNA還與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝炎等疾病的發(fā)生有關(guān)[8]。

然而，有關(guān)circRNA在婦產(chǎn)科疾病中的作用研究甚少。此次研究分析了circRNA在PE患者和正常妊娠婦女胎盤(pán)組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)44個(gè)circRNA在實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)，45個(gè)circRNA低表達(dá)。這89個(gè)circRNA中有75個(gè)circRNA與has-let-7家族成員有結(jié)合位點(diǎn)，且大多數(shù)還可以和miR-100或miR-101、miR-103家族成員結(jié)合。

Let-7 是一種低氧反應(yīng)型miRNA，在缺氧條件下，let-7 的表達(dá)增加，通過(guò)相關(guān)的調(diào)控通路，調(diào)節(jié)機(jī)體的適應(yīng)能力，維持機(jī)體正常的生理狀態(tài)。Let-7與內(nèi)皮細(xì)胞的很多生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，如促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生、抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)內(nèi)皮通透性影響血管形成，參與細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[9]，還可通過(guò)調(diào)控Ⅲ型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體3來(lái)影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力[10]。Let-7在PE患者胎盤(pán)中高表達(dá)，上調(diào)的Let-7可以通過(guò)靶向調(diào)控ephrin-B2/Eph 受體B4系統(tǒng)影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過(guò)程，從而加速PE進(jìn)程[11]，說(shuō)明let-7家族成員在PE中的異常表達(dá)可能與PE的病理過(guò)程存在一定相關(guān)性。

有研究[12-13]顯示miR-100、miR-101、miR-103在PE患者胎盤(pán)組織中表達(dá)水平低于正常妊娠婦女。MiR-100被認(rèn)為是一種新型上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，但它又能抑制腫瘤發(fā)生、遷移和侵襲。如miR-100通過(guò)靶向HOXA1抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[14]。MiR-100-5p可以通過(guò)環(huán)氧化酶2抑制血管生成[15]。此外，Cao et al[16]發(fā)現(xiàn)miR-100可通過(guò)靶向CXCR7抑制癌細(xì)胞增殖。PE 過(guò)程中伴隨著胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)的增加，有研究表明干擾miR-101 表達(dá)后凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-101在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激期間參與調(diào)節(jié)一些凋亡蛋白，通過(guò)在PE中靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44來(lái)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層HTR-8 / SVneo細(xì)胞的凋亡過(guò)程[13]。MiR-103是一種原癌基因，過(guò)表達(dá)的miR-103a通過(guò)下調(diào)p57來(lái)激活mTOR通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并抑制凋亡[17]。

因此，circRNA可能通過(guò)與let-7、miR-100、miR-101以及miR-103結(jié)合，抑制其生物學(xué)功能，從而參與到PE的發(fā)病機(jī)制中。 但是，circRNA如何通過(guò)調(diào)控miRNA來(lái)影響PE的發(fā)生發(fā)展，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。當(dāng)然，此次研究也存在很多不足之處。① 實(shí)驗(yàn)樣本量過(guò)少，代表性不夠，后續(xù)研究還需擴(kuò)大樣本量來(lái)加以論證；② 樣本來(lái)自同一地區(qū)，可能有地域性差異。

綜上所述，胎盤(pán)組織circRNA表達(dá)的失調(diào)可能與PE發(fā)病和病理生理過(guò)程有關(guān)。本研究為深入了解PE的發(fā)病機(jī)理提供了新的線索，并為改善PE的預(yù)防與診療水平提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。