芬戈莫德對腎小管上皮細胞NLRP3炎性體激活的影響

丁麗紅，包 婷，李丹丹，倪海鋒，袁 亮，郝 麗，王德光

(1.安徽醫科大學第二附屬醫院腎臟內科，安徽 合肥 230601；2. 東南大學附屬中大醫院腎臟內科，江蘇 南京 210009)

芬戈莫德(fingolimod)，又稱FTY720，是從冬蟲夏草培養液中提取、分離出來，并經過一系列修飾加工而成的一種新開發的免疫抑制劑[1]。芬戈莫德的作用機制不同于常規的免疫抑制劑，目前對芬戈莫德發揮其免疫抑制作用和免疫調控作用機制的研究主要集中在促進淋巴細胞歸巢、誘導淋巴細胞凋亡等，但到目前為止，其確切的作用機制仍不清楚。

NLRP3炎性體是由NLRP3、ASC和pro-caspase-1組成的多蛋白復合體，可以活化caspase-1，釋放IL-1β和IL-18，從而促進各種炎癥性和免疫性疾病的發生和發展。我們之前體內、外的研究發現，腎小管上皮細胞內的NLRP3炎性體激活在白蛋白導致的腎小管間質炎癥反應中發揮著重要作用。本文擬通過體內、外實驗研究芬戈莫德是否通過抑制NLRP3炎性體激活而發揮抗炎免疫作用，從而探討芬戈莫德的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞健康♂， Wistar大鼠40只，清潔級，體重(130～160) g，購自軍事醫學科學院動物實驗中心，生產許可證sexk(軍)2012-004。細胞來源：HK-2細胞株為人近端腎小管上皮細胞的永生系，購自武漢大學細胞保藏中心。

1.2 藥物與試劑芬戈莫德粉劑(美國selleckchem 批號S500207)；SP試劑盒(福州邁新 Kit 9921)；NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和β-actin(美國Santa Cruz)；TRIzol試劑(美國Invitrogen)；反轉錄試劑盒 (日本TaKaRa)；本研究所用引物由南京金斯瑞科技有限公司設計及合成。

1.3 儀器石蠟切片機(德國萊卡公司)；顯微鏡(日本Olympus，BX41)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；7300型Real-time PCR儀(美國ABI公司)。

1.4 實驗動物分組、造模、給藥大鼠適應性喂養1周，行右腎切除術1周后隨機分為五組：對照組(n=8)，經腹腔注射與牛血清白蛋白(BSA，5 g·L-1)等體積的0.9%生理鹽水；蛋白負荷腎病模型組(n=8)，經腹腔注射BSA(5 g·L-1)；不同濃度芬戈莫德干預組(每組n=8)，經大鼠腹腔注射BSA(5 g·L-1)的同時給予大鼠灌胃芬戈莫德(0.25，0.5，1 mg·kg-1)。

1.5 細胞分組及藥物處理HK-2細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中，培養液為含5%胎牛血清的DMEM/F12。將HK-2細胞接種在6孔培養板，培養至部分融合或全部融合時，用無血清DMEM/F12培養液洗2次后，去血清培養24 h，然后細胞分組如下：①加入正常培養液的正常對照組；②加入高濃度BSA(20 g·L-1)刺激的模型組；③高濃度BSA刺激HK-2細胞后加入不同濃度芬戈莫德(1，10，100 nmol·L-1)的干預組。

1.6 大鼠腎組織PAS和Masson染色大鼠腎臟組織用福爾馬林固定后，脫水、透明、石蠟包埋成蠟塊，切片(厚2～3 μm)，常規脫蠟至水后行PAS及Masson染色。每例切片顯微鏡下隨機選取10個互不重疊的腎間質視野進行腎臟損傷評分。評分內容包括：腎小管萎縮、小管間質纖維化、有無蛋白管型、間質炎性細胞浸潤程度等。小管間質損傷評分標準：0分：正常；1分：皮質損傷范圍<25%；2分：25%～50%；3分：>50%。

1.7 大鼠腎組織免疫組化染色蠟塊切片(厚3～4 μm)后常規脫蠟，水化，枸櫞酸鈉、微波修復后，用SP試劑盒(福州邁新 Kit 9921)檢測NLRP3 (1 ∶ 100)、caspase-1(1 ∶ 50)、IL-1β(1 ∶ 100)、IL-18(1 ∶ 100)，PBS作為陰性對照，顯微鏡下觀察拍照。

1.8 Western印跡取大鼠新鮮腎組織或收集培養板中的細胞，加適量RIPA裂解液，離心取上清液，按試劑盒說明書操作檢測蛋白濃度。取等量蛋白樣本變性后SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入NLRP3(1 ∶ 1 000)、caspase-1(1 ∶ 500)、IL-1β(1 ∶ 1 000)和IL-18(1 ∶ 1 000)一抗，放置4 ℃冰箱過夜。最后TBST洗膜，加入TBST稀釋的二抗 (1 ∶ 5 000)，室溫孵育2 h， ECL化學發光法曝光。以β-actin(1 ∶ 1 000)作為內參。

1.9 熒光實時定量PCR用TRIzol試劑提取大鼠腎組織或培養細胞的總RNA，對總RNA進行純度、濃度及完整性的測定。用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA。10 μL反應體系，置于PCR儀中進行反轉錄。以雙蒸水代替cDNA模板作為陰性對照。所用引物由南京金斯瑞科技有限公司設計及合成，引物序列如Tab 1所示。

2 結果

2.1 芬戈莫德對蛋白負荷腎病大鼠腎臟炎癥和纖維化的影響PAS及Masson染色結果顯示，與對照組相比，蛋白負荷腎病模型組腎小管上皮細胞顆粒變性或空泡變性明顯，小管腔內可見蛋白管型，部分腎小管灶性萎縮，間質中有較多的淋巴細胞和單核巨噬細胞浸潤，間質有輕度纖維化，小管間質損傷評分明顯升高；與模型組相比，0.25 mg·kg-1芬戈莫德組腎小管上皮細胞顆粒變性或空泡變性稍有改善，腎小管灶性萎縮減輕，間質中淋巴細胞和單核巨噬細胞浸潤有所減少，小管間質損傷評分較模型組稍有下降，0.5 mg·kg-1和1 mg·kg-1芬戈莫德組明顯減弱了蛋白尿導致的腎小管間質炎癥和纖維化，且小管間質損傷評分明顯下降(Fig 1)。

2.2 芬戈莫德對蛋白負荷腎病大鼠腎臟組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表達的影響免疫組化結果顯示，NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18在對照組的腎小管上皮細胞中僅有少量表達，在模型組中的表達均較對照組增強。與模型組相比，0.25 mg·kg-1芬戈莫德可抑制腎小管上皮中的NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達，0.5 mg·kg-1和1 mg·kg-1芬戈莫德組則抑制作用更加明顯(Fig 2)。

2.3 芬戈莫德對蛋白負荷腎病大鼠腎臟組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白和mRNA表達的影響Western印跡結果顯示(Fig 3A)，與對照組相比，模型組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達均明顯升高；與模型組相比，0.25 mg·kg-1芬戈莫德組NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達均有所減少，而0.5 mg·kg-1和1 mg·kg-1芬戈莫德組則明顯降低。熒光實時定量PCR結果顯示(Fig 3B)，模型組腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達均高于對照組；與模型組相比，0.25 mg·kg-1芬戈莫德可抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達，0.5 mg·kg-1和1 mg·kg-1芬戈莫德可明顯抑制上述mRNA的表達。組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

1：Control;2:Model;3: Fingolimod 0.25 mg·kg-1;4: Fingolimod 0.5 mg·kg-1; 5: Fingolimod 1 mg·kg-1. A: PAS and Masson staining of the rat renal tissues ( × 200); B: Tubulointerstitial injury score.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsModel group.

Tab 1 Primer sequences of several genes for real-time PCR

Fig 2 Expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β and IL-18 in rat renal tissues by immunohistochemical staining(× 200)

2.4 芬戈莫德對白蛋白刺激的HK-2細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白和mRNA的表達的影響在體外實驗中，收集各組細胞分別做Western印跡和熒光實時定量PCR，檢測各組細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白和mRNA的表達情況。Western印跡結果顯示(Fig 4A)，模型組細胞NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達均較對照組明顯升高，用不同濃度的芬戈莫德干預后，與模型組相比，1 nmol·L-1芬戈莫德可抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達，10 nmol·L-1和100 nmol·L-1芬戈莫德可抑制各蛋白的表達。熒光實時定量PCR結果顯示(Fig 4B)，與對照組相比，模型組細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達均升高；而與模型組相比，1 nmol·L-1芬戈莫德可抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達，10 nmol·L-1和100 nmol·L-1芬戈莫德組有明顯的抑制作用，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

芬戈莫德是1995年日本Fujita教授從冬蟲夏草(子囊菌亞門赤僵菌)培養液中提取并分離出的一種鞘氨醇樣抗生素——多球殼菌素 (又名嗜熱菌殺酵母素)，化學名：2-amino-2[-2-(4-octyophenyI)ethyI]-1,3-propanedioI hydrochIoride；分子式：C19H33NO2·HCl；分子量：343.94 道爾頓。芬戈莫德是一種新型免疫抑制劑，該制劑從結構和作用機制上不同于傳統的免疫抑制劑，如他克莫司、環孢素以及雷帕霉素等[2]。芬戈莫德具有較強的免疫抑制作用，且毒副作用小，生物利用度高，并與常規免疫抑制劑具有協同作用，在2010年9月22日被美國食品藥品監督管理局批準為自身免疫性疾病多發性硬化癥的一線口服藥物，其免疫抑制效果明顯優于其他免疫抑制劑[3]。

Fig 3 In uence of fingolimod on expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β, and IL-18 in rat renal

A: Western blot; B:real-time PCR. 1: Control; 2: Model; 3: Fingolimod 0.25 mg·kg-1; 4: Fingolimod 0.5 mg·kg-1; 5: Fingolimod 1 mg·kg-1.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsModel group.

芬戈莫德藥理作用獨特，目前研究認為其免疫抑制機制可能有3種：①“歸巢”學說：芬戈莫德可能通過調節淋巴細胞的分化、遷移以及炎性因子的產生，使淋巴細胞歸巢并“滯留”在淋巴結及腸道集合淋巴結等次級淋巴器官中，抑制淋巴組織內淋巴細胞的游出，從而減少外周血中淋巴細胞的數量[4]。芬戈莫德在發揮免疫抑制和免疫調控作用的同時并不影響淋巴細胞的激活和增殖，也不損害機體的免疫記憶功能和免疫應答[5]。②“細胞凋亡”學說：芬戈莫德可以誘導淋巴細胞的凋亡，可能與Bcl-2家族[6]、內質網釋放Ca2+引起鈣超載、Fas/FasL等有關[7]，還有研究表明，芬戈莫德誘導的細胞凋亡與其抑制Akt-NF-κB信號，促進抗凋亡蛋白Mcl-1的蛋白酶體降解以及增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成的能力有關[8]。③通過作用神經鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate，S1P)抑制淋巴細胞外流：研究表明，芬戈莫德主要是通過拮抗S1P與淋巴細胞表面的S1P1受體，使淋巴細胞滯留在淋巴器官內，減少淋巴細胞外流而發揮相應的免疫抑制作用[9]。但到目前為止，上述作用機制并不能很好的解釋芬戈莫德在體內的相關現象和全部作用機理，仍需尋找芬戈莫德的其他作用機制。

Fig 4 In uence of fingolimod on expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β, and IL-18 in HK-2

A: Western blot; B:real-time PCR.1: Control; 2: Model; 3: Fingolimod 1 nmol·L-1; 4: Fingolimod 10 nmol·L-1; 5: Fingolimod 100 nmol·L-1.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsModel group.

炎性體是機體固有免疫及應激系統的重要防御成分，其中NLRP3炎性體是目前研究最為深入且在多種細胞中表達的炎性體，各種內源性或外源性的刺激可通過不同的信號通路激活NLRP3炎性體，使caspase-1活化，引起IL-1β、IL-18等促炎細胞因子成熟分泌，進而促進炎癥的發生[10]，多種藥物通過調節NLRP3炎性體激活而發揮抗炎等作用[11]。我們既往的體內實驗研究表明，蛋白尿可導致腎小管上皮細胞NLRP3炎性體激活，IL-1β和IL-18水平升高，使間質內淋巴細胞及單核細胞浸潤，最終導致慢性腎小管間質炎癥和纖維化的發生，從而導致慢性腎臟病的進展[12]。在體外實驗中，我們用高濃度BSA體外長時間刺激HK-2細胞后，發現白蛋白是通過刺激Cathepsin B釋放和ROS生成這兩種途徑激活腎小管上皮細胞中的NLRP3炎性體[13]。因此NLRP3炎性體激活在腎小管間質炎癥的發生、發展中起到重要作用，抑制NLRP3炎性體激活可以抑制腎小管間質炎癥。

芬戈莫德在腎臟疾病研究領域中除了在腎移植中的免疫抑制作用研究較多外，在其他腎臟疾病中也有廣泛研究，如芬戈莫德可改善5/6腎大部切除大鼠的炎癥和纖維化程度[14]，通過不同的機制對腎臟缺血/再灌注、腎小球腎炎及糖尿病腎病等動物模型均有腎臟保護作用，保護腎小管上皮細胞及足細胞避免凋亡、抗纖維化等作用，減緩腎缺血/再灌注損傷并發癥等[15]。而Scheiblich等[16]在神經酰胺對小膠質細胞中NLRP3炎性體激活的研究中發現，芬戈莫德可以使脂多糖誘導的小膠質細胞中NLRP3炎性體激活后caspase-1和IL-1β的水平升高。但是本研究發現芬戈莫德可抑制蛋白負荷大鼠腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達，從而改善大鼠腎臟炎癥和纖維化的程度。這可能與芬戈莫德作為S1P受體調節劑，與存在不同細胞表面的5種S1P受體之間有不同的相互作用有關，尤其是神經細胞，芬戈莫德作為多發性硬化癥的一線口服藥物，對不同的神經細胞作用可能更為復雜，其機制目前尚未完全清楚。而我們的實驗發現，對于白蛋白引起的腎小管間質的非免疫性炎癥，芬戈莫德同樣可發揮抗炎作用，而且與抑制腎小管上皮細胞中NLRP3炎性體激活有關。另外，本實驗為了排除存在芬戈莫德對淋巴細胞的歸巢、凋亡、抑制外流影響的可能，我們又設計了體外實驗，在體外沒有淋巴細胞的影響下，芬戈莫德同樣可抑制白蛋白導致的腎小管上皮細胞中NLRP3炎性體的激活，使IL-1β和IL-18的表達減少，這提示芬戈莫德可能是通過抑制NLRP3炎性體激活而抑制炎癥的發生和發展，這可能是芬戈莫德發揮抗炎的另一個作用機制。

總之，本研究發現芬戈莫德可抑制腎小管上皮細胞NLRP3炎性體激活，從而減輕腎小管間質炎癥和纖維化。雖然芬戈莫德抗炎免疫作用的具體機制目前仍不明確，本實驗表明芬戈莫德可能通過抑制腎小管上皮細胞NLRP3炎性體激活而發揮作用，這為芬戈莫德作為抗炎免疫藥物在腎臟疾病的治療中發揮作用提供了新的思路和實驗證據。