人源重建皮膚模型的體外光毒性試驗方法建立

康 樺，張勁松，桑 晶，匡 榮

(浙江省食品藥品檢驗研究院，化妝品動物替代試驗技術(shù)重點實驗室，杭州 310004)

紫外光照射人體皮膚會產(chǎn)生輻射毒性[1]。光毒性評估是化學物質(zhì)、藥品和化妝品安全性評估的重要內(nèi)容。近年來，動物試驗檢測光毒性的方法逐漸被體外評估系統(tǒng)替代。目前已被驗證和認可的體外評估方法有經(jīng)濟合作與發(fā)展組織化學品測試指導原則中的《體外3T3細胞中性紅攝取光毒性試驗方法》(OECD 432)[2]，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中的《化妝品用化學原料體外3T3中性紅攝取光毒性試驗》[3]。但是，目前采用的體外檢測系統(tǒng)存在著較大缺陷。首先，這種單層培養(yǎng)的成纖維細胞系統(tǒng)相對于三維皮膚是一種簡單的基礎系統(tǒng)。其次，一些非水溶性的化學物質(zhì)因為難溶于水只能用低濃度檢測。此外，該系統(tǒng)不能檢測許多復雜的混合物或者配方產(chǎn)品。重建皮膚模型光毒性試驗是一個有意義的潛在替代方法。目前，已有研究者開發(fā)了利用人源重建皮膚模型EpiSkin的體外光毒性試驗方法。先前研究認為該方法能夠評估化學物終產(chǎn)品和復雜配方的光毒性[4]。中國廣東博溪生物科技有限公司研發(fā)了人源重建皮膚模型EpiKutis，并已應用在皮膚刺激性和腐蝕性試驗方面。我們針對國產(chǎn)人源重建皮膚模型在光毒性評估方面做進一步研究，以期建立中國人源重建皮膚模型EpiKutis體外光毒性試驗方法。隨后，我們選取一些已知的化學物對該方法進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1皮膚模型 EpiKutis是由廣東博溪生物科技有限公司提供，貨號PM1011。EpiKutis是以中國人皮膚組織分離出的角質(zhì)形成細胞為種子細胞，使用精細調(diào)節(jié)的無血清培養(yǎng)基促使細胞在體外發(fā)育成復層化結(jié)構(gòu)的3D表皮模型。EpiKutis具有高度類似于人類皮膚的復層化結(jié)構(gòu)、生理及代謝功能。

1.1.2主要試劑 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Aladdin，批號：I1402131)；異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160108)；培養(yǎng)液(廣東博溪生物科技有限公司，貨號：PY3031A/B/C)；磷酸鹽緩沖液(HBSS)(GIBCO，貨號：14025-092，批號：1836493)；丙酮(TEDIA，批號：15110659)。

1.1.3受試物 鹽酸氯丙嗪(CAS：69-09-0)(東京化成工業(yè)株式會社，批號：E7X5M-Es)；鹽酸異丙嗪(CAS：58-33-3)(SIGMA，批號：SZBE023XV)；8-甲氧基補骨脂(CAS：298-81-7)(SIGMA，批號：MKBT6032V)；十二烷基硫酸鈉(CAS：151-21-3)(SIGMA，批號：SLBJ7382V)。

1.1.4主要儀器 HERAcell 150i型號二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；SpectraMax 190型號紫外-可見光連續(xù)光譜酶標儀(Molecular Devices Corporation公司)；XS104型號電子天平(METTLER TOLEDO公司)；SOL 500 RF2型號光源(Honle UV technology公司)；UV-Meter μC型號光照度儀(Honle UV technology公司)。

1.2 方法

1.2.1預培養(yǎng) 將EpiKutis放入已加入0.9 mL培養(yǎng)液的六孔板中。在標準條件(37 ℃±1 ℃、5%±1% CO2、95%相對濕度)下預培養(yǎng)1 h，隨后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)在標準條件下預培養(yǎng)24 h。

1.2.2受試物處理 次日將EpiKutis轉(zhuǎn)移到新的六孔板中。在不同光照時間對皮膚模型相對活性的影響試驗時，每個EpiKutis給予50 μL HBSS。在不同濃度鹽酸氯丙嗪對皮膚模型光毒性作用試驗時，給予濃度為1 000、200、100、20和4 mg·L-1的鹽酸氯丙嗪溶液50 μL。在陽性對照鹽酸氯丙嗪溶液濃度確定試驗時，給予濃度為200、100 mg·L-1的鹽酸氯丙嗪溶液50 μL。在已知的4個化學物對EpiKutis體外光毒性

Tab 1 Effect of UVA exposure time on cell viability of EpiKutis n=3)

*P<0.05,**P<0.01vs60 min

Tab 2 Phototoxic effect of different doses of chlorpromazine on EpiKutis after UVA n=3)

**P<0.01vsnon-UVA exposure (-UVA)

試驗方法的驗證試驗時，給予鹽酸氯丙嗪、鹽酸異丙嗪、8-甲氧基補骨脂、十二烷基硫酸鈉等4個化學物溶液50 μL，受試物溶液濃度見Tab 5。以上試驗中陰性對照均給予50 μL HBSS。8-甲氧基補骨脂溶液溶劑為丙酮，陰性對照溶液為丙酮。給予受試物溶液后EpiKutis繼續(xù)在標準條件下培養(yǎng)過夜。

1.2.3光照 d3給予EpiKutis光照強度為(1.7±0.1) mW·cm-2的長波紫外線(ultraviolet A, UVA)照射。在不同光照時間對皮膚模型相對活性的影響試驗時，分別分組進行光照40、60、80、100 min處理，不光照處理的皮膚模型放置在同一室溫的暗處；其余試驗均光照60 min處理。光照處理完成后的EpiKutis轉(zhuǎn)移到新的六孔板中，每孔加0.9 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜(21 h)。

1.2.4活性檢測 d 4進行MTT檢測，將EpiKutis轉(zhuǎn)移至已加入0.3 mL的1.0 g·L-1MTT溶液的24孔板中，標準條件培養(yǎng)3 h。取出EpiKutis放入新的24孔板中，每個孔加入2 mL異丙醇，室溫震蕩2 h溶解甲瓚。隨后從上述每個EpiKutis中吸取200 μL含甲瓚的溶液分別加到96孔板中，采用異丙醇作為空白對照。測定570 nm波長處吸光度值。除不同光照時間對皮膚模型相對活性的影響試驗時，相對活性為光照后吸光度值與此相對應的不光照的吸光度值的比值，其余試驗的相對活性均為受試物吸光度值與陰性對照吸光度值的比值。

2 結(jié)果

2.1 不同光照時間對皮膚模型相對活性的影響光照80 min或100 min后明顯降低EpiKutis細胞活性。40 min或60 min光照對EpiKutis細胞活性幾乎無影響。因此，確定選用60 min為光照時間。見Tab 1。

2.2 不同濃度鹽酸氯丙嗪對皮膚模型光毒性作用鹽酸氯丙嗪在100、200 mg·L-1濃度時對EpiKutis有輕微的細胞毒性，在1 000 mg·L-1濃度時有嚴重的細胞毒性。鹽酸氯丙嗪在20、100及200 mg·L-1濃度時對皮膚模型有光毒性作用，且隨濃度增大光毒性作用增強。鹽酸氯丙嗪在4 mg·L-1濃度時對皮膚模型既無細胞毒性也無光毒性作用。見Tab 2。

2.3 陽性對照鹽酸氯丙嗪溶液濃度確定鹽酸氯丙嗪溶液濃度為100、200 mg·L-1時光照后皮膚模型相對活性降低平均值均為30%以上。見Tab 3。

Tab 3 Phototoxic effect of 100, 200 mg·L-1 chlorpromazine on EpiKutis after UVA exposure

*P>0.05vs100 mg·L-1

濃度為100、200 mg·L-1的鹽酸氯丙嗪溶液對皮膚模型有一定的細胞毒性，100 mg·L-1時細胞毒性較輕微。因此，我們確定陽性對照鹽酸氯丙嗪溶液的濃度為100 mg·L-1。見Tab 4。

Tab 4 Effect of 100, 200 mg·L-1 chlorpromazine on cell viability of EpiKutis

*P<0.05vs100 mg·L-1

2.4 已知的4個化學物對EpiKutis體外光毒性作用結(jié)果見Tab 5。

3 討論

目前，已經(jīng)通過驗證的用于評估化學物光毒性風險的方法是《體外3T3細胞中性紅攝取光毒性試驗方法》(OECD 432)[2]。然而，這個方法采用的是單層細胞體系，其最大的缺點是水難溶性化學物質(zhì)和化妝品配方產(chǎn)品不能采用這個方法。具有復雜的三維結(jié)構(gòu)的皮膚模型能模擬全身性給藥途徑的化學物質(zhì)吸收方式。EpiKutis存在有機的結(jié)構(gòu)(多層和分化的表皮)、屏障功能(角質(zhì)層)、基本構(gòu)成細胞的來源(角質(zhì)形成細胞來源于人類皮膚)等這些特性，更能模擬人類體內(nèi)的環(huán)境。因而，可以應用于對具有不同生物化學特性的大多數(shù)化學物質(zhì)，如疏水性或固體化學物質(zhì)、復雜的混合物或配方等產(chǎn)品的光毒性檢測。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中《化妝品用化學原料體外3T3中性紅攝取光毒性試驗》：光源要求為UVA，透過96孔組織培養(yǎng)板蓋的光強度建議為(1.7±0.1) mW· cm-2, 照射劑量為5 J·cm-2[3]。OECD的指導原則《體外3T3中性紅光毒性試驗》(OECD 432)中對光源的規(guī)定為：光源為UVA，光照強度為(1.7±0.1) mW·cm-2，照射劑量為5 J·cm-2，照射細胞時間為50 min[2]。從試驗結(jié)果我們可以得到：40、60 min光照時間對皮膚模型活性幾乎無影響。因此確定光照條件為：光源UVA、光照強度(1.7±0.1) mW·cm-2、光照時間60 min。

Tab 5 Phototoxic effect of four chemicals on EpiKutis after UVA exposure

*P<0.05 ,**P<0.01vsnon-UVA exposure (-UVA)

研究資料表明：UVA照射后，鹽酸氯丙嗪會導致皮膚模型活性劑量依賴性顯著降低，與不光照皮膚模型相比活性均下降超過25%[4-7]。皮膚模型Skin2的試驗數(shù)據(jù)已經(jīng)通過驗證：皮膚模型光照處理后相對活性比不光照處理降低30%以上認為該受試物有光毒性作用[5,8]。其他皮膚模型也通過試驗對結(jié)果評價標準相對活性比降低30%以上進行了驗證[6,7]。本試驗結(jié)果表明，在鹽酸氯丙嗪溶液濃度為100、200 mg·L-1時，皮膚模型光照處理后相對活性比不光照處理均降低30%以上。鹽酸氯丙嗪在100、200 mg·L-1濃度時對皮膚模型有一定的細胞毒性，濃度為100 mg·L-1時細胞毒性比較輕微。所以陽性對照鹽酸氯丙嗪溶液的濃度確定為100 mg·L-1。因此，確定《人源重建皮膚模型(EpiKutis)體外光毒性試驗方法》結(jié)果評價標準為：皮膚模型光照處理后相對活性比不光照處理降低30%以上認為該受試物有光毒性作用。

我們選取一些已知的化學物質(zhì)進行方法驗證：鹽酸氯丙嗪、鹽酸異丙嗪、8-甲氧基補骨脂為已知的光毒性化學物；十二烷基硫酸鈉為已知的光毒性陰性化學物。4個化學物皮膚模型相對活性降低試驗數(shù)據(jù)與歷史參考數(shù)據(jù)比較大體一致[9]。鹽酸氯丙嗪、鹽酸異丙嗪、8-甲氧基補骨脂為有光毒性化學物；十二烷基硫酸鈉為無光毒性化學物。試驗結(jié)果表明上述4個化學物通過《人源重建皮膚模型(EpiKutis)體外光毒性試驗方法》進行檢測，能夠正確評估其光毒性。因此，我們認為《人源重建皮膚模型(EpiKutis)體外光毒性試驗方法》能夠初步評估化學物的光毒性，可以推薦為皮膚光毒性替代檢測方法。