新型鈰摻雜碳量子點的構建及其對乳腺癌細胞的殺傷作用

蔡茸， 張靜靜， 徐麗霞， 劉蘇婉， 劉勁靜， 龔愛華， 張苗苗， 杜鳳移

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

近年來，碳量子點因其優異的光學和化學性質以及許多潛在的應用而受到人們的廣泛關注[1-3]。目前，由于其水分散性好、化學惰性強、光穩定性強、細胞毒性低以及生物相容性好等優點，碳量子點在生物工程領域掀起了研究熱潮。本課題組前期的研究證明，碳量子點在抗氧化功能[4]、CT成像功能[5]和載基因功能[6]等領域表現出巨大潛能。

光熱消融(photothermal ablation, PTA)是近幾年發展起來的一種新型腫瘤治療手段，具有精確、可控、高效和不良反應少等優點[7-8]。PTA主要利用具有高效光熱轉換效率的材料富集在腫瘤部位，并在外部光源的照射下將光能轉化為熱能來殺死腫瘤細胞，從而抑制腫瘤生長[9-10]。盡管PTA在腫瘤治療中表現出一定的效果，但尚缺乏生物相容性好、光熱轉化性能高的光敏劑，所以在一定程度上阻礙了其在臨床上的廣泛應用。有研究報道稱，碳基納米材料具有較好的光熱轉換性能[11-12]。鑒于此，本文旨在探索制備新型高效光熱轉換效率的納米光敏劑鈰摻雜的碳量子點(cerium doped carbon quantum dots, Ce-doped CDs)，及其抑制腫瘤生長的能力。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

草酸鈰(上海阿拉丁試劑公司)；甘氨酸(德國biofroxx公司)；胎牛血清和DMEM(美國Hyclone公司)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；微波爐(廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司)；高分辨透射電子顯微鏡(日本東京喬爾有限公司)；熒光光譜儀(美國瓦里安公司)；全自動數碼凝膠圖像分析儀(南京麥高德生物科技有限公司)；808 nm激光器(北京鐳志威光電技術有限公司)；熱成像攝像機(東莞新泰儀器有限公司)；酶標儀(美國比奧泰克儀器公司)。

1.2 Ce-doped CDs的制備

稱取0.2 g草酸鈰溶解于24 mL去離子水(含4 mL濃鹽酸)中，在85 ℃下持續攪拌1 h，再加入0.8 g甘氨酸，攪拌0.5 h，形成透明液體。將溶液轉移到微波爐中高火加熱10 min以得到碳化的黑色塊狀物，倒入20 mL水溶解。黑色溶液以2 000 r/min離心10 min去除沉淀，將上清液透析、凍干，得到的黑色粉末即Ce-doped CDs。

1.3 Ce-doped CDs的形貌和光學表征

采用透射電子顯微鏡在200 kV加速電壓下觀察Ce-doped CDs的形貌特征，同時，利用熒光光譜儀檢測Ce-doped CDs的熒光信號。

1.4 Ce-doped CDs的光熱效能

將Ce-doped CDs配成不同濃度(40、80、120、160、200 μg/mL)水溶液，在功率密度為1.0 W/cm2的808 nm近紅外激光下照射各水溶液，同時，以去離子水作為對照組，另外，再用不同功率密度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 W/cm2)的808 nm近紅外激光照射200 μg/mL 的Ce-doped CDs水溶液，每隔30 s記錄溫度變化的數值。為了探究Ce-doped CDs的光熱再生性和穩定性，將200 μg/mL 水溶液置于1.0 W/cm2的808 nm近紅外激光照射下進行5次加熱-冷卻循環。

1.5 細胞活力實驗

采用CCK-8法測定不同濃度的Ce-doped CDs對細胞活力的影響。將1.5×104個MEF細胞(小鼠胚胎成纖維細胞系)和4T1細胞(人乳腺癌細胞系)分別接種于96孔板中孵育24 h，加入不同濃度的Ce-doped CDs(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL)孵育48 h，再加入CCK-8試劑，使用酶標儀測定450 nm處每孔的光密度。另外，為了檢測光照對加入不同濃度Ce-doped CDs的細胞活力的影響，將不同濃度Ce-doped CDs(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL)孵育的細胞置于808 nm激光下照射5 min，24 h后加入CCK-8試劑測定光密度。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 Ce-doped CDs的形貌表征

高倍透射電子顯微鏡觀察結果(圖1A)顯示，制備的Ce-doped CDs形態均一、近似顆粒狀，在室溫下均勻分散于水中且無明顯沉淀。另外，更加高倍視野的透射電子顯微鏡圖像顯示Ce-doped CDs具有混合相結構，即同時具有非晶格和晶格兩種結構，如圖1B所示，線條圈出納米顆粒，箭頭所指區域能清楚地看到晶格結構。同時，Image J軟件分析所制得的粒徑分布曲線符合高斯正態分布，如圖1C所示，該曲線顯示Ce-doped CDs的平均尺寸約為(2.59±0.37) nm，符合高斯正態分布曲線。

A、B：Ce-doped CDs的高倍透射電鏡圖；C：Ce-doped CDs的粒徑分布

圖1 Ce-doped CDs的透射電鏡圖和粒徑分布

2.2 Ce-doped CDs的光學性能

利用熒光光譜檢測Ce-doped CDs的熒光性能。Ce-doped CDs的光譜圖(圖2A)顯示熒光光譜的發射波長與激發波長有很密切的聯系，雖然隨著激發波長以20 nm為間隔從320 nm增加到440 nm，發射光譜從417 nm移動到505 nm，但其熒光強度在360 nm激發波長下開始增加，達到峰值后再逐漸遞減。歸一化發射光譜之后，如圖2B可以看出，隨著激發波長的增加，Ce-doped CDs的發射光譜發生了約40 nm的紅移。同時，在360 nm激發波長下觀察到440 nm處的最大發射(圖2C)。

2.3 Ce-doped CDs的光熱性能

固定近紅外光功率為1.0 W/cm2，研究不同濃度Ce-doped CDs溶液的溫度變化。如圖3顯示，溶液溫度變化呈現明顯的濃度依賴性。值得注意的是，Ce-doped CDs在200 μg/mL濃度下經過光照6 min即可達到55.1 ℃，通過調節Ce-doped CDs的溶質含量，使溶液的溫度精確控制在20 ℃～55 ℃，而對照組在同等照射條件下溫度無明顯變化。

A：不同激發波長下 Ce-doped CDs的熒光光譜圖；B：Ce-doped CDs的歸一化熒光光譜圖；C：最大激發波長下Ce-doped CDs的最大發射光譜圖2 表征Ce-doped CDs的光學性能

A：不同濃度Ce-doped CDs在近紅外光(808 nm)激發下的光熱曲線圖；B：相應的近紅外熱成像圖圖3 不同Ce-doped CDs濃度下的光熱成像圖

隨后，固定Ce-doped CDs濃度為200 μg/mL，研究不同功率密度的近紅外光對溫度變化的影響。如圖4所示，Ce-doped CDs的溫度升高與功率密度呈正相關。

A： 不同功率密度下Ce-doped CDs在近紅外光(808 nm)激發下的光熱曲線圖；B：相應的近紅外熱成像圖圖4 不同功率密度下的光熱成像圖

另外，利用激光開-關5個循環周期對Ce-doped CDs的光熱重復性和穩定性進行研究。結果表明，所獲得的溫度變化曲線圖在5個周期內相互匹配良好(圖5)。以上結果說明制備的Ce-doped CDs具有非常可靠的光熱轉換穩定性，且光熱轉換效率呈現濃度和功率密度依賴性。

圖5 Ce-doped CDs水溶液在5個激光開關周期內的溫度變化曲線圖

2.4 Ce-doped CDs的細胞活力實驗

如圖6A所示，MEF和4T1細胞在不同濃度的Ce-doped CDs作用下依舊顯示很好的生物相容性以及低毒性，甚至在高濃度1 200 μg/mL下對細胞活力也無顯著影響。與對照組相比，不同濃度Ce-doped CDs孵育過的細胞活力差異無統計學意義(P>0.05)。

測量近紅外激光照射經Ce-doped CDs孵育過的細胞活力結果顯示，隨著Ce-doped CDs濃度的增加，在相同近紅外激光(808 nm，1.0 W/cm2)照射下，細胞活力逐漸遞減。如圖6B、6C所示，無論是正常細胞MEF還是腫瘤細胞4T1，都有相同的變化趨勢，值得注意的是，在其他條件均一致的情況下，4T1細胞活力下降趨勢更加明顯，在1 200 μg/mL濃度的Ce-doped CDs處理下，MEF細胞依舊有79%的存活率，而4T1細胞僅剩7%。這說明我們制備的Ce-doped CDs具有很好的光熱轉換性能，同時，由于腫瘤細胞對溫度變化更加敏感，所以其光熱殺傷效果更加顯著。

A：Ce-doped CDs的生物相容性；B、C：808 nm(1.0 W/cm2，5 min)近紅外激光下Ce-doped CDs對MEF細胞和4T1細胞的殺傷性能

圖6 Ce-doped CDs的生物相容性和體外細胞近紅外殺傷性能

3 討論

本研究以草酸鈰和甘氨酸為前驅物，通過微波水熱碳化法合成Ce-doped CDs。其形態均一、粒徑微小、生物相容性好，具有混合物相結構。Ce-doped CDs表現出與傳統碳量子點類似的熒光性能，表面存在空洞結構，這使得其通過空洞進行能量儲存而導致光致發光成為可能[13]。值得注意的是，Ce-doped CDs還具備優越的光熱轉換效率與可重復利用性。用相同功率密度(1.0 W/cm2)照射不同濃度的Ce-doped CDs水溶液，甚至最低濃度為40 μg/mL時，其光熱轉換效果也很顯著；用不同功率密度的近紅外光照射相同濃度的Ce-doped CDs水溶液，甚至是低功率密度(0.2 W/cm2)，與純水接收最高功率密度(1.0 W/cm2)近紅外光照射相比，其光熱轉換能力依舊很高。這不僅證明Ce-doped CDs的光熱轉換效率與濃度和功率密度皆呈正相關，還說明其光熱轉換能力突出，只需極低濃度或功率密度即可發揮作用。

更重要的是，Ce-doped CDs具有高效的近紅外光熱轉換性能，可在808 nm波長的近紅外光照射下將溶液迅速升溫至55.1 ℃，從而顯著抑制乳腺癌細胞的生長。關閉光熱開關后可迅速恢復到室溫，而再次連續加熱4次，在同樣的時間段內依舊能夠達到之前的溫度，這說明反復間斷近紅外照射不會影響Ce-doped CDs的光熱轉換效果，具有可重復利用性。而正常細胞卻表現出較好的熱耐受性，可顯著降低光熱消融對正常組織的損傷，提高對腫瘤細胞的特異性殺傷能力。因此，本研究制備的Ce-doped CDs在乳腺癌的光熱治療領域表現出一定的應用潛能，將豐富和改變目前臨床上抗腫瘤的治療模式和治療思路。