分泌型cGMP依賴性蛋白激酶Ⅱ對胃癌細胞增殖相關基因表達的調控

李幗瑞， 龐吉， 錢海， 吳燕， 陳永昌

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

蛋白質磷酸化是最常見的蛋白翻譯后修飾之一[1]。多數蛋白質磷酸化發生在胞內，由分布在細胞內的蛋白激酶催化完成。但是，細胞外的蛋白質也有磷酸化的現象，早在1883年，就已發現細胞外蛋白質酪蛋白的磷酸化，但引起其磷酸化的蛋白激酶一直未找到[2]。直到130年后，Tagliabracci發現Fam20C作為一種分泌型蛋白激酶在起作用[2-3]。自此，分泌型蛋白激酶引起人們高度重視，陸續發現VLK、c-Src酪氨酸激酶等多種分泌型蛋白激酶[4-6]。研究發現，cGMP依賴性蛋白激酶Ⅱ(type Ⅱ cGMP-dependent protein kinase，PKG Ⅱ)也是一種分泌型蛋白激酶[7]。但是，分泌到胞外的PKG Ⅱ對細胞的作用及機制尚不明確。 為此，本研究采用重組蛋白PKG Ⅱ在細胞外直接作用于胃癌細胞的方式來模擬分泌型蛋白的作用模式，并利用轉錄組測序分析進行初步篩選， 結合實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和蛋白質免疫印跡進行進一步驗證，初步探索分泌型PKG Ⅱ對人胃癌HGC-27和AGS細胞株基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和試劑 人胃癌HGC-27和AGS細胞株購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清(美國Excell公司)；RPMI-1640培養液，二甲基亞砜，焦碳酸二乙酯均為美國Hyclone公司產品；F12K培養液(加拿大Wisent公司)；人谷胱甘肽轉移酶(GST)-PKG Ⅱ融合蛋白(加拿大Signalchem公司)；8-pCPT-cGMP(美國Biolog公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒，qRT-PCR試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；β-巰基乙醇(美國Sigma公司)；蛋白質標準參照物(美國Thermo Fisher公司)；抗人表皮生長因子(EGF)前體多克隆抗體(美國Novus公司)；β-肌動蛋白抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP標記的羊抗兔多克隆抗體(美國Jackson公司)；ECL發光液(美國Millipore公司)。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；細胞培養箱，高速冷凍離心機，普通PCR儀均為美國Thermo Fisher公司產品；倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)；恒溫水浴鍋(上海福瑪實驗設備有限公司)；超微量蛋白核酸分析儀(北京美林恒通儀器有限公司)；超聲波細胞破碎儀(美國Emerson公司)；實時熒光定量PCR儀，蛋白電泳儀均為美國Bio-Rad公司產品；干式恒溫器(北京百晶生物技術有限公司)；凝膠成像及分析系統(北京賽智公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胃癌HGC-27細胞株培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，AGS細胞培養于含10%胎牛血清的F12K培養液中，置37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 總RNA抽提及逆轉錄 采用Trizol法提取總RNA，用超微量蛋白核酸分析儀對得到的樣品進行濃度及純度鑒定。將D(260 nm)/D(280 nm)在1.8～2.0之間的樣品逆轉錄為cDNA，立即進行后續研究或置于-20℃保存備用。

1.2.3 轉錄組測序分析 轉錄組測序廣泛應用于各個物種基因差異表達的研究，現有的商業化深度測序技術中Illumina HiSeq 2000具有高輸出量和低成本的優勢，是目前應用最為廣泛的測序平臺之一[8-9]。對使用谷胱甘肽硫轉移酶標簽在桿狀病毒Sf 9昆蟲細胞中表達的重組全長人PKG Ⅱ(GST-PKG Ⅱ, 100 μg/L)處理前、后的胃癌AGS細胞株轉錄組進行測序：加藥4 h后提取細胞中總RNA，行質量檢測，采用Illumina HiSeq 2000高通量測序平臺對濃度、純度和完整性符合測序質量要求的樣品進行轉錄組測序。該部分實驗交由南京集思慧遠生物科技有限公司完成。將整理后的轉錄本通過基于局部對比算法的搜索工具(BLAST)BLASTn及BLASTx程序與蛋白相鄰類的聚簇(COG)、基因本體(Gene Ontology, GO)、京都基因與基因組百科全書(KEGG)、真核生物蛋白相鄰類的聚簇(KOG)、Pfam、Swiss-prot和NR非冗余蛋白序列數據庫等7個公共數據庫對比。以FDR≤0.05、│log2(FPKMGST-PKG II組/FPKM對照組) │>1為條件篩選出表達差異≥2倍的基因，再從中篩選出部分與增殖相關的基因進行驗證。

1.2.4 qRT-PCR驗證重組PKG Ⅱ對篩選出的增殖相關基因mRNA水平的影響 將匯合度達70%左右的HGC-27和AGS細胞消化后接種于6孔板，分為2組：對照組和GST-PKG Ⅱ (100 μg/L)+ 8-pCPT-cGMP(250 μmol/L)組。待細胞匯合度達到70%時，換無血清培養液饑餓處理8～12 h；棄上清液，無菌PBS清洗；加入相應濃度藥物處理4 h。提取總RNA，逆轉錄為cDNA用于qRT-PCR。PCR反應體系：2×SYBR Green Ⅰ預混試劑5 μL，前引物(5 μmol/L)0.4 μL，后引物(5 μmol/L)0.4 μL，模板1 μL，加雙蒸水將體系總體積調整至10 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。用2-ΔΔCt法計算候選基因的相對表達量，實驗重復3次。qRT-PCR所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白質免疫印跡檢測EGF前體的表達 培養細胞，待匯合度達70%時用胰蛋白酶消化，接種于6孔板中，分為5組：對照組、GST(100 μg/L)組、GST-PKG Ⅱ(100 μg/L)組、GST+8-pCPT-cGMP(250 μmol/L)組、GST-PKG Ⅱ+8-pCPT-cGMP組。待細胞匯合度達60%～70%時,更換無胎牛血清的培養液饑餓處理8～12 h；棄培養液，PBS沖洗；加相應濃度的藥物處理24 h；裂解細胞，提取總蛋白，煮沸變性后于-20 ℃保存備用。取20 μg行SDS-PAGE，70 V恒壓電泳；冰上300 mA恒流120 min，將蛋白轉移至PVDF膜；5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；目的條帶用以5%牛血清白蛋白1 ∶500稀釋的EGF前體蛋白多克隆抗體4 ℃孵育過夜；TBST清洗3次，再分別以TBST 1 ∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗兔多克隆抗體和β-肌動蛋白抗體室溫孵育目的條帶和內參1 h；TBST清洗3次；ECL發光液顯色、凝膠成像系統掃描成像后用Image J軟件進行灰度掃描分析；實驗重復3次。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 表達受重組PKG Ⅱ調節的基因轉錄組測序篩選

對GST-PKG Ⅱ處理前、后的胃癌AGS細胞株轉錄組進行測序，質控后分別得到24.36 Gb和27.61 Gb的數據。對拼接后的轉錄組進行全轉錄組注釋，將組裝后的轉錄本通過BLASTn及BLASTx程序與COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-prot和NR共7個公共數據庫對比，分別獲得7 034、16 850、10 729、13 308、18 575、18 311和20 227條同源對比信息，具體如表2所示。

共篩選出579個差異表達基因。其中，在GST-PKG Ⅱ作用下267個基因表達明顯上調，312個顯著下調(圖1)。將所篩選出的差異表達基因與COG數據庫對比，共獲得93個注釋信息，劃分為19個功能類別：分布最多的是一般功能預測基因，達31個(R)；其次為涉及氨基酸轉運與代謝的功能基因(E)，共有11個；功能涉及復制、重組與修飾(L)以及信號轉導機制(T)的基因各有10個，詳見圖2。

表2 胃癌細胞株AGS全轉錄組功能注釋結果

虛線以下的點無意義；虛線以上的點表示FDR≤0.05且│log2(FPKMGST-PKG II組/FPKM對照組)│>1的基因；其中，右側虛線以右者表示在GST-PKG Ⅱ作用后表達上調，左側虛線以左者表示表達下調

圖1 差異表達基因火山圖

A：RNA加工和修飾；B：染色體結構和動力學；C：能量生成與轉化；D：細胞周期調控，細胞分裂，染色體分離；E：氨基酸轉運與代謝；F：核酸轉運與代謝；G：碳水化合物轉運與代謝；H：輔酶轉運與代謝；I：脂類轉運與代謝；J：翻譯，核糖體結構與生物發生；K：轉錄；L：復制，重組與修飾；M：細胞壁/細胞膜生物發生；N：細胞活性；O：翻譯后修飾，蛋白質折疊，伴侶；P：無機離子轉運和代謝；Q：次級代謝物生物合成，轉運及代謝；R：一般功能預測；S：未知功能；T：信號轉導機制；U：細胞間運輸，分泌物和膜泡運動；V：防御機制；W：胞外結構；Y：核結構；Z：細胞骨架

圖2 差異表達基因COG功能注釋分布圖

對579個差異表達基因進行GO富集分析，共獲得2 749個注釋。將其功能劃分為細胞組分、分子功能和生物過程三大類：其中，關于生物過程的注釋最多，共有1 254個；其次為細胞組分，有1 089個GO注釋；分子功能有406個注釋。全轉錄組及差異表達基因GO功能分類的詳細情況見圖3。

每個亞分類中左側表示全部基因的GO功能注釋數，右側代表差異表達基因的GO功能注釋數圖3 GO功能分類

進一步功能分類顯示，579個差異表達基因中，58個與腫瘤生物學活動密切相關，20個與神經系統功能相關，9個與心臟活動有關，具體如圖4所示。根據對差異表達基因的功能注釋，提示分泌型PKG Ⅱ參與細胞生長、神經系統以及心臟活動等多種生物功能調節。重點篩選出與腫瘤細胞增殖相關的9個候選基因(EGF、FGF7、MARK1、GLI1、COL6A3、DFNA5、SEPT4、DACT1、PSCA，分別編碼表皮生長因子、成纖維細胞生長因子7、微管親和調節激酶1、膠質瘤相關癌基因1、Ⅵ型膠原蛋白α3鏈、耳聾相關基因Gasdermin-E、Septin-4、β-環連蛋白抑制基因1、前列腺干細胞抗原)，進行后續驗證及分析。

圖中顏色深淺表示與對照組相比的表達差異，顏色越深表明表達差異越大；↓：表達下調的基因；*：后續重點篩選出的候選基因

圖4 部分差異表達基因及其功能注釋

2.2 重組PKG Ⅱ對腫瘤細胞增殖相關基因轉錄水平的影響

qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，在GST-PKG Ⅱ和8-pCPT-cGMP共同作用下，HGC-27和AGS細胞中FGF7和MARK1等mRNA水平比較均無明顯差異(P均>0.05)；EGFmRNA水平明顯降低(P<0.01)，DFNA5、DACT1、PSCA等mRNA水平明顯增高(P<0.01或<0.05)，與轉錄組測序一致；兩個細胞株中GLI1、COL6A3和SEPT4 等mRNA水平比較，差異有統計學意義，但表現出相反的趨勢，表明重組PKG Ⅱ在不同胃癌細胞株中發揮的作用并不完全一致(圖5)。

2.3 重組PKG Ⅱ對胃癌細胞中EGF表達的影響

如圖6所示，HGC-27細胞中，與對照組及GST組相比，GST-PKG Ⅱ組、GST+cGMP組和GST-PKG Ⅱ+cGMP組EGF前體蛋白水平均明顯下調(P均<0.01)，且與GST-PKG Ⅱ組相比，GST-PKG Ⅱ+cGMP組EGF前體蛋白水平下調更為明顯(P<0.01)；AGS細胞中，與對照組相比，GST組、GST-PKG Ⅱ組、GST+cGMP組和GST-PKG Ⅱ+cGMP組EGF前體蛋白表達水平均明顯降低(P均<0.01)，但與GST-PKG Ⅱ組相比，GST-PKG Ⅱ+cGMP組EGF前體蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較圖5 增殖相關基因的mRNA水平

1：對照組；2：GST組；3：GST-PKG Ⅱ組；4：GST+8-pCPT-cGMP組；5：GST-PKG Ⅱ+8-pCPT-cGMP組；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與GST-PKG Ⅱ組比較；c：P<0.01，與GST組比較

圖6 各組EGF前體蛋白表達水平比較

3 討論

為研究PKG Ⅱ作為分泌型蛋白激酶對腫瘤基因表達的調控作用，本研究首先通過轉錄組測序分析篩選出579個差異表達基因，267個基因表達顯著上調，312個顯著下調，涉及腫瘤生物學活動、神經系統功能和心臟功能等多個方面。這些差異表達基因中個別基因的功能也有部分重疊：其中CDON具有抑制增殖和遷移、促進腫瘤細胞凋亡的作用，同時參與神經前體細胞遷移和神經元分化的正調節，在心肌重塑中也發揮一定的作用[10-13]。為增加研究結果的可靠性，本研究采用HGC-27和AGS兩個細胞株對轉錄組測序結果進行qRT-PCR驗證，結果顯示從579個差異表達基因中篩選出的9個候選基因中有4個mRNA水平的變化趨勢在兩個細胞株中均與轉錄組測序結果一致，即在重組PKG Ⅱ作用下，EGF表達下調，而DFNA5、DACT1和PSCAmRNA表達上調。由此表明，該測序結果對研究分泌型PKG Ⅱ對細胞基因表達的影響有一定的參考價值。

進一步得到驗證的4個基因——EGF、DFNA5、DACT1和PSCA在腫瘤細胞增殖中均具有重要的調控作用：Akino等[14]發現，DFNA5/GSDME因異常甲基化所致的沉默在原發性胃癌中常有發生，而將外源DFNA5導入NUGC3沉默細胞可抑制新霉素抗性菌落形成，逆轉胃癌細胞對化療藥物的耐藥性，提示DFNA5可能在胃癌中起到生長抑制作用；Rogers等[15]發現活化的caspase-3可以裂解DFNA5/GSDME，產生靶向透化質膜的壞死性DFNA5-N末端片段，介導細胞凋亡。DACT1啟動子甲基化在許多研究中均有報道，包括胃癌[16]、食管鱗狀細胞癌[17]和鼻咽癌[18]等，其異常甲基化與腫瘤的發生發展及患者的不良預后密切相關[16-17]，在體內和體外試驗中均表現出對胃癌的抑制作用[19]。DACT1過表達還可通過抑制KG-1α增殖、促進細胞凋亡進而抑制白血病發生和進展[20]。PSCA在前列腺癌中高表達，但在胃癌和食管癌中卻幾乎不表達[21]，敲除PSCA基因在體外和體內均能促進胃癌細胞增殖，體外試驗中PSCA高表達可抑制胃癌AGS細胞增殖[22]。多篇文獻報道EGF與腫瘤細胞增殖密切關聯[23-24]。由此得出，分泌型PKG Ⅱ可能通過下調EGF表達，同時上調DFNA5、DACT1和PSCA表達，促進胃癌細胞凋亡，抑制胃癌細胞增殖，最終抑制腫瘤生長。

除了對腫瘤細胞增殖相關基因的調節作用外，本次測序結果還顯示重組PKG Ⅱ對神經系統功能調控和心臟活動的眾多基因都有明顯的調節作用。例如，重組PKG Ⅱ除了可以通過調節編碼鈉/鈣交換蛋白2的SLC8A2(NCX2)表達抑制腫瘤生長[25-26]；還可通過增強SLC8A2表達，維持突觸完整性和突觸密度、保證正常的認知和記憶[27]；此外，PKG Ⅱ還可能通過上調編碼二氫嘧啶脫氫酶4的DPYSL4表達，從而促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長[28]，保證神經突的正常形成、神經元正常分化，增加樹突的數量及長度[29]?？梢?，分泌型PKG Ⅱ除了可以通過調節腫瘤生物學活動相關基因的表達，影響腫瘤細胞生長，還可能參與調控神經系統和心血管系統的活動。

對EGF前體蛋白水平的檢測結果進一步顯示，在GST-PKG Ⅱ作用下，HGC-27和AGS細胞中EGF前體蛋白水平較對照組明顯降低，加入8-pCPT-cGMP后，GST-PKG Ⅱ對HGC-27細胞中EGF前體蛋白表達的抑制作用更為明顯。GST對HGC-27細胞中EGF前體表達無抑制作用，而cGMP加入可能引起細胞中內源性PKG Ⅱ的激活，進而導致EGF前體表達下調。對于AGS細胞株，GST對EGF前體表達也有一定的抑制作用，但與GST組相比，重組PKG Ⅱ組EGF前體表達明顯降低(P<0.01)，表明重組蛋白GST-PKG Ⅱ中PKG Ⅱ對EGF前體表達有抑制作用，而非單純GST起作用。cGMP的加入同樣可能導致AGS細胞株中內源性PKG Ⅱ的激活，從而引起EGF前體表達降低。在AGS細胞株中，GST-PKG Ⅱ+cGMP組與GST-PKG Ⅱ組相比差異無統計學意義，表明cGMP激活并不能增強重組PKG Ⅱ對EGF前體蛋白表達的抑制作用。

綜上所述，PKG Ⅱ能夠作為一種分泌型蛋白激酶調控EGF的轉錄和翻譯，但其抑制EGF表達的機制有待進一步探索。