剛地弓形蟲RH株速殖子外泌體的分離與鑒定

凌薇， 宋玉潔， 汪慧， 朱昱蓉， 袁琳， 馬雨潤， 程芳， 姜旭淦， 陳盛霞

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種可以感染所有溫血動物的專性細胞內寄生蟲，可引起人畜共患病弓形蟲病[1-2]。全球約有三分之一的人口感染剛地弓形蟲，大多數表現為隱性或無癥狀感染。弓形蟲感染常導致人類和動物的先天性疾病和流產[3-4]。弓形蟲病常為艾滋病患者或其他免疫力嚴重低下人群的并發癥[2,5]。

外泌體(exsomes)是一種直徑為30～150 nm的納米級囊泡，通過多泡體與質膜融合而分泌到細胞外。這些小囊泡含有多種生物活性分子，包括蛋白質、脂質和核酸等，不僅具有免疫調節功能[6-7]，還在物質信息傳遞、細胞間通訊中起關鍵作用[8-9]。根據外泌體的來源和大小，已有5種外泌體分離技術，分別是超高速離心技術、基于尺寸的分離技術、聚合物沉淀技術、免疫親和捕獲技術和最近發展的微流體衍生技術，并在聚合物沉淀技術的基礎上開發出更加成熟的外泌體提取試劑盒[10]。外泌體的特征可以通過其大小、蛋白質和脂質含量來描述，也可以通過檢測其形態特征、粒徑和表面標志來鑒別[11]。

研究發現，寄生蟲的外泌體或微囊泡能夠作用于宿主細胞，調控宿主細胞的基因表達和免疫反應，參與寄生蟲致病過程[12]。其中，研究較多的有利什曼原蟲、錐蟲、惡性瘧原蟲和陰道毛滴蟲等[7]；而對于弓形蟲的研究相對較少[13]，并且弓形蟲生活史復雜及蟲株多樣，給弓形蟲外泌體研究造成了一定的困難。本研究探討弓形蟲RH株速殖子與細胞共培養條件下外泌體的分離和鑒定，為弓形蟲外泌體的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株、細胞株、主要試劑

弓形蟲RH株速殖子和人結腸癌SW480細胞株由本課題組液氮保存。RPMI 1640培養基和胎牛血清(以色列BI公司)，CD63和HSP70抗體(美國Proteintech公司)，表面抗原1(surface antigen 1，SAG1)、棒狀體蛋白16(rhoptry protein 16，ROP16)、ROP18、致密顆粒蛋白1(dense granule protein 1，GRA1)兔多克隆抗體由本課題組制備[14-17]，羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術有限公司)，0.22 μm濾器、ECL化學發光顯色液和15 mL 100 000濃縮柱(美國Millipore公司)，外泌體提取試劑(美國System Biosciences公司)。

1.2 細胞培養及上清液收集

將胎牛血清經4 ℃、100 000×g離心16 h，收集上層1/3液體，并通過0.22 μm濾器過濾除菌，制備成除外泌體胎牛血清。常規復蘇SW480細胞，用含有10%胎牛血清RPMI 1640培養基于T25培養瓶中常規培養SW480細胞，待細胞密度達到80%～90%時，吸棄培養液，PBS洗2次，加入含1%除外泌體胎牛血清RPMI 1640培養基，繼續培養24 h，收集培養液(此為細胞培養上清液)，-80 ℃保存備用。

1.3 弓形蟲與細胞共培養上清液及速殖子蛋白制備

常規復蘇弓形蟲RH株速殖子，參照文獻[18]方法在SW480細胞中連續傳代獲得弓形蟲速殖子；在T25細胞培養瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養SW480細胞，待細胞生長密度達到80%～90%時，吸棄培養液，換成含1%除外泌體胎牛血清培養基，接種5×106個弓形蟲速殖子繼續培養；每隔8 h于倒置顯微鏡下觀察細胞和蟲體生長情況；24 h可見蟲體假包囊形成，3～4 d內細胞全部被脹破，速殖子游離在培養基中。收集此時的培養物， 3 200×g離心10 min，上清液即為弓形蟲與細胞共培養上清液，-80 ℃保存備用。

在上述共培養沉淀中加入1×PBS重懸，300×g離心5 min，吸取上清液，再重復上述操作2次。上清液經3 200×g離心10 min，沉淀重懸于1×PBS中，凍融3次。加入蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF=99 ∶1)，在冰上以60 W/s超聲2 min，4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液。用Bradford法測定蛋白含量，-80 ℃保存備用。

1.4 外泌體分離

將收集的弓形蟲速殖子與細胞共培養上清液和細胞培養上清液于4 ℃下分別經300×g離心10 min，收集上清液，再經2 000×g離心20 min；繼續收集上清液，經10 000×g離心30 min。吸取上清液，加入15 mL 100 000濃縮柱，4 ℃、1 000×g離心30 min，吸取濃縮液體；濃縮液通過0.22 μm濾器除菌，以5 ∶1比例加入外泌體提取試劑，4 ℃過夜；4 ℃、1 500×g離心30 min，管底可見淡黃色至白色沉淀，吸棄上清液；4 ℃、1 500×g再離心5 min，吸棄殘留上清液，以1 ∶1比例加入1×PBS溶解沉淀(此為外泌體)，分裝后-80 ℃保存。

1.5 透射電鏡觀察外泌體形態

用移液器吸取50 μL外泌體懸液于潔凈載玻片上，將載樣銅網倒扣于懸液上，注意區分銅網正反面，室溫靜置3 min，自然干燥；滴加2%磷鎢酸復染3 min，濾紙吸干殘留液，白熾燈下烤10 min，透射電鏡觀察拍照。

1.6 納米粒子跟蹤分析儀檢測外泌體大小

用1×PBS緩沖液稀釋分離的外泌體樣品，使用ZetaView PMX 110儀器及其相應的ZetaView 8.04.02軟件對稀釋后的樣本進行納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)以測量外泌體的粒徑和濃度；實驗中，在11個位置記錄和分析NAT測量值，以110 nm聚苯乙烯顆粒校準ZataView系統，溫度保持在23 ℃～27 ℃。

1.7 蛋白質印跡法檢測外泌體標志蛋白和弓形蟲特異蛋白

將外泌體樣本、弓形蟲蛋白樣本分別與上樣緩沖液混勻，100 ℃水中煮10 min備用。樣本分別用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以80 V恒壓電泳120 min，300 mA恒流轉印90 min，使蛋白轉至預先經甲醇活化的PVDF膜上。用含5%的脫脂奶粉TBST室溫封閉2 h，分別加入CD63抗體(1 ∶500)、HSP70抗體(1 ∶500)、SAG1抗體(1 ∶100)、ROP16抗體(1 ∶100)、ROP18抗體(1 ∶100)、GRA1抗體(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應的二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育1 h，洗膜3次，加ECL化學發光試劑顯色并拍照。

2 結果

2.1 弓形蟲外泌體超微結構

透射電鏡結果顯示，弓形蟲外泌體呈圓形或橢圓形的囊泡樣，囊泡外周可見膜性結構，大小具有異質性，直徑為30～150 nm，腔內部顯示低電子密度成分，背景清晰，無污染(圖1)。

圖1 弓形蟲外泌體透射電鏡觀察

2.2 弓形蟲外泌體粒徑分析結果

分離獲得的外泌體3 000倍稀釋，利用NTA技術檢測外泌體的粒徑大小。結果顯示，弓形蟲外泌體平均粒徑大小為119.5 nm(圖2A)；直徑大多在30～150 nm，占總數的87.8%(圖2B)。

A：外泌體粒徑大小分布；B：外泌體粒徑大小百分比

圖2 弓形蟲外泌體納米粒徑分析

2.3 蛋白質印跡結果

弓形蟲外泌體與SW480細胞外泌體均有CD63和HSP70蛋白的表達(圖3A)。弓形蟲分泌蛋白SAG1、ROP16、ROP18、GRA1檢測結果顯示，弓形蟲外泌體與弓形蟲速殖子中均有這些蛋白表達，而在SW480細胞外泌體中卻未檢測到(圖3B)。

A：外泌體標志蛋白；B：弓形蟲特異蛋白圖3 弓形蟲外泌體標志蛋白和弓形蟲特異蛋白分析

3 討論

有研究報道采用體外單獨培養方法，收集弓形蟲培養上清液，可分離弓形蟲速殖子外泌體[13, 19]。本研究早期也采用這個方法，但分離的外泌體濃度低，原因可能是經3 μm濾膜純化時，速殖子受外力擠壓、破壞，離開細胞時間過長，蟲體活力降低，外泌體的分泌減少。本研究用蟲體與細胞共培養[20]，收集從蟲體侵入細胞開始到細胞破裂、蟲體游離整個過程的培養上清液，蟲體增殖旺盛，分泌較多外泌體；而且這種方法更接近蟲體與宿主細胞作用的自然狀態，后續研究更能揭示蟲體外泌體的真實作用。盡管分離的外泌體中存在少量細胞分泌的外泌體，但在后續實驗中，以細胞培養上清液分離的外泌體作為對照，即可消除共培養細胞外泌體的干擾作用。

外泌體分離方法中最常用的是試劑盒法和超速離心法。超速離心法是經典分離方法，是分離外泌體的金標準[21]，操作簡單，適合大體積樣本的分離，不適用于微量及珍貴樣本的研究。Linares等[22]報道，超速離心會造成外泌體損失，使外泌體易聚集，降低外泌體的質量及產量，破壞囊泡的完整性，進而影響下游分析。試劑盒法是基于聚合物沉淀技術、實現外泌體快速分離純化的分離方法，操作簡單，無需特殊的技術及設備。Tang等[23]報道，與超速離心法相比，試劑盒法分離的外泌體回收率更高，可用于下游分析試驗，但其易受其他非外泌體污染，導致外泌體純度降低。本研究在試劑盒法的基礎上，通過多次離心、濃縮、過濾等操作，成功從細胞與速殖子共培養上清液中分離出外泌體，從而保證了后續實驗的進行。

本研究根據Li等[13]報道的弓形蟲外泌體鑒定方法，通過透射電鏡、NTA及蛋白質印跡技術對分離的外泌體超微結構、粒徑大小、表面標志進行鑒定。實驗結果表明，分離的外泌體呈圓形或橢圓形的囊泡樣，囊泡外周可見膜性結構，粒徑范圍為30～150 nm，含有外泌體表面標志蛋白CD63、HSP70和弓形蟲特異蛋白SAG1蛋白，從而確定弓形蟲外泌體分離成功。Li等[13, 24]研究發現，弓形蟲釋放的外泌體能夠激活巨噬細胞，刺激促炎因子分泌，觸發宿主免疫反應，對弓形蟲感染有局部保護作用。本研究嘗試檢測速殖子其他重要蛋白，結果顯示弓形蟲外泌體含有蟲體分泌蛋白ROP16、ROP18、GRA1。這些蛋白是由弓形蟲速殖子細胞器(如棒狀體、致密顆粒和微線體等)分泌，在弓形蟲入侵宿主細胞過程中發揮重要作用。這些蛋白的檢出表明，外泌體可能作為弓形蟲分泌蛋白排出細胞的一種途徑，參與弓形蟲的致病、免疫調節等過程。因此，進一步研究弓形蟲外泌體的蛋白或酶等其他組分，分析其在弓形蟲感染中的作用，可為弓形蟲與宿主相互作用及其機制的研究提供新思路。