線粒體活性氧在心肌成纖維細胞NLRP3炎癥小體激活中的作用

顏駿， 張浩， 王好， 陶艾彬， 姚永偉， 張國輝， 芮濤

(江蘇大學附屬人民醫院心內科， 江蘇 鎮江 212002)

臨床上膿毒癥并發心功能障礙的發病率高且死亡率高[1]。但是膿毒癥引起心功能損傷的機制尚不清楚，也欠缺有效的針對性治療。

有文獻報道，白介素(IL)-1β與膿毒癥心肌功能損傷相關[2]，IL-1β的生成和調控與炎癥小體相關。炎癥小體是一類存在于細胞質中的蛋白復合體，能識別細胞內病原相關分子模式(PAMPs)或損傷相關分子模式(DAMPs)等，通過介導IL-1β和IL-18的生成，調控炎癥相關基因表達等方式產生各種生物學效應[3-4]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體可對多種物理、化學刺激做出反應，如活性氧(ROS)、外源性三磷酸腺苷(ATP)等[5-6]。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和caspase-1前體組成。NLRP3小體有多種活化途徑，經典的為雙信號途徑，分為引發和激活兩個階段。引發階段胞質內的NLRP3和IL-1β前體的合成增多，激活階段通過活化的caspase-1進一步生成IL-1β和IL-18，發揮生物學作用[7]。

目前影響NLRP3炎癥小體激活的因素尚未完全明確。我們之前的研究顯示，使用脂多糖刺激6 h，可使心肌成纖維細胞內NLRP3、pro-IL-1蛋白合成增多，再使用ATP刺激30 min，可激活NLRP3炎癥小體，產生IL-1β和IL-18。并通過“細胞交互作用”與高遷移率族蛋白B1聯合作用，引起心肌細胞收縮功能減弱[8]。本研究使用線粒體活性氧(mtROS)靶向清除劑mito-TEMPO減少炎癥小體激活階段心肌成纖維細胞胞內mtROS的表達，探討mtROS在心肌成纖維細胞NLRP3炎癥小體激活中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C57BL/6小鼠購自江蘇大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK(蘇)2013—0011。IL-1β鼠抗體、NLRP3兔抗體、ASC兔抗體、脂多糖、ATP(Cell Signaling Technology公司)；caspase-1鼠抗體(Novus Biologicals公司)；兔多克隆β-肌動蛋白抗體、羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司)；羊抗鼠IgG抗體(美國Bio-world公司)； mito-TEMPO、Hoechst 33342、膠原酶、中性蛋白酶(美國Sigma-Aldrich公司)；培養基DMEM/F12(維森特生物技術有限公司)；胎牛血清(ExCell Bio公司)；測定IL-1β的酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國RδD Systems公司)；MitoSOX(美國Thermo Fisher公司)；細胞裂解液、蛋白A/G瓊脂糖珠、蛋白酶抑制劑混合物、BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術有限公司)；其他試劑都為化學分析純。

1.2 小鼠成纖維細胞的分離和培養

取3～4周雌雄不限的C57BL/6小鼠6只，以斷頸法處死，于超凈工作臺在無菌條件下取出心臟，將心臟在冷D-Hanks液中切割為約1 mm3的組織小塊后，浸沒于膠原酶(0.002 g/mL)和中性蛋白酶(0.001 g/mL)中，在37 ℃、5%CO2培養箱緩慢振蕩45 min，取上清液1 500 r/min離心5 min，去除上清液后加入含10%胎牛血清的DMEM到培養皿中。如此反復2～3次，收集所得細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中，3 h后去除未貼壁細胞懸液，剩余貼壁細胞每日更換培養基，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，培養72 h可用于實驗[9]。

1.3 實驗分組

取培養的心肌成纖維細胞分為4組處理。引發組：加入含0.001 ng/L脂多糖的培養基處理6.5 h；激活組：先加入含0.001 ng/L脂多糖的培養基，6 h后加入3 mmol/L的 ATP，繼續培養0.5 h[10]；干預組：先加入含0.001 ng/L脂多糖的培養基，5.5 h后加入25 μmol/L的mito-TEMPO[11]，0.5 h后再加入3 mmol/L的ATP，維持0.5 h；對照組：加入常規培養基6.5 h后，添加與干預組試劑等量的D-Hanks液。

1.4 MitoSOX染色觀察小鼠心肌成纖維細胞mtROS表達

將處理好的各組心肌成纖維細胞去除培養基后，使用D-Hanks液洗滌3次，加入5 μmol/L的MitoSOX，37 ℃避光孵育10 min[12]，去除染液并再次清洗后，加入0.001 μg/L的Hoechst 33342染液37 ℃避光孵育10 min，去除染液并再次清洗后在熒光顯微鏡(Zeiss LSM880, 美國)下觀察、拍照。胞質中mtROS呈紅色，細胞核呈藍色，每組觀察10個細胞，通過Image J軟件分析熒光強度數值后取平均值，重復3次。

1.5 蛋白質印跡法檢測細胞Pro-IL-1β、ASC、NLRP3、Pro-caspase-1蛋白表達

收集4組細胞提取蛋白，取10 μL樣品由10%SDS-PAGE電泳轉移到PVDF膜上。5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別使用一抗IL-1β(1 ∶1 000)、ASC(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶1 000)、caspase-1(1 ∶1 000)、β-肌動蛋白(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000)、羊抗鼠IgG抗體(1 ∶5 000)室溫孵育2 h。Bio-Rad曝光儀攝像，以β-肌動蛋白作為內參，Image J軟件分析灰度值。

1.6 蛋白質印跡法檢測細胞上清液中IL-1β和caspase-1 p20蛋白表達

分別收集4組細胞上清液，將上清液與無水甲醇、氯仿混合，4 ℃以15 000×g離心15 min，去除上清液，加入無水甲醇800 μL，再4 ℃以15 000×g離心15 min，去除上清液后得到所需提取蛋白。所提取蛋白通過蛋白印跡法分別檢測caspase-1 p20、IL-1β蛋白表達。

1.7 ELISA法檢測小鼠心肌成纖維細胞上清液中IL-1β蛋白含量

將4組細胞上清液各50 μL加入微孔板室溫孵育2 h，洗滌后加入100 μL酶標檢測抗體室溫孵育2 h，再次洗滌后加入顯色劑混合物100 μL室溫孵育30 min。加入終止液100 μL，30 min內使用酶標檢測儀測量450 nm的光密度值，設置540 nm作為校正波長。根據標準曲線計算出各組標本中IL-1β蛋白含量。

1.8 免疫共沉淀法檢測與ASC結合的NLRP3及Pro-caspase-1蛋白的表達

心肌成纖維細胞用混合有蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液裂解后，15 000×g，4 ℃離心15 min，收集上清液。將蛋白A/G瓊脂糖珠與上清液混合，4 ℃搖晃20 min；再以4 ℃，12 000 r/min離心15 min，所得上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。將兔抗ASC單克隆抗體(31 μg)加入到含500 μg總蛋白的上清液中，將所得混合物在4 ℃以4 000×g離心5 min，去上清液，將上樣緩沖液加入到瓊脂糖珠-抗原抗體復合物中。將混合物煮5 min，取上清液行SDS-PAGE并轉移至PVDF膜，并用針對小鼠ASC、NLRP3和Pro-caspase-1蛋白的抗體進行蛋白質印跡。

1.9 統計分析

2 結果

2.1 各組小鼠心肌成纖維細胞mtROS比較

如圖1所示，小鼠心肌成纖維細胞受脂多糖和ATP刺激后，mtROS水平較對照組明顯增加(P<0.05)；使用mito-TEMPO干預后，mtROS水平較激活組明顯下降(P<0.05)，但仍明顯高于對照組(P<0.05)。

n=3； #：P<0.05，與對照組比較；*：P<0.05，與激活組比較圖1 mitoSOX染色觀察小鼠心肌成纖維細胞mtROS水平

2.2 各組心肌成纖維細胞NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達

如圖2所示，心肌成纖維細胞經脂多糖刺激后，細胞內NLRP3和Pro-IL-1β蛋白較對照組明顯升高(P<0.05)，而Pro-caspase-1、ASC的表達無明顯變化；經ATP激活和mito-TEMPO干預后，干預組中Pro-IL-1β較激活組升高(P<0.05)。

使用ATP激活NLRP3炎癥小體，上清液中caspase-1 p20和IL-1β較對照組明顯升高(P<0.05)，而干預組使用mito-TEMPO降低mtROS后使caspase-1 p20和IL-1β較激活組明顯減少(P<0.05)。ELISA檢測結果顯示，激活組上清液中IL-1β含量較對照組明顯升高(P<0.05)，干預組上清液中IL-1β含量較激活組明顯減少(P<0.05)。見圖3。

2.3 各組心肌成纖維細胞中NLRP3、Pro-caspase-1與ASC結合情況

免疫共沉淀法檢測可見，經脂多糖和ATP刺激后，心肌成纖維細胞中NLRP3-ASC連接形成復合體，干預組NLRP3和ASC的結合減少。而Pro-caspase-1蛋白不受影響。見圖4。

① 對照組； ② 引發組； ③ 激活組； ④ 干預組n=3； #：P<0.05，與對照組比較；*：P<0.05，與激活組比較圖2 各組心肌成纖維細胞胞內NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達

① 對照組； ② 引發組； ③ 激活組； ④ 干預組n=3； #：P<0.05，與對照組比較；*：P<0.05，與激活組比較圖3 各組心肌成纖維細胞上清液中NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達

圖4 免疫共沉淀法檢測各組心肌成纖維細胞NLRP3和ASC的結合

3 討論

IL-1β的生成增加是膿毒癥引發心肌收縮力下降和膿毒癥休克的重要因素[13]，IL-1β的生成、成熟、分泌受NLRP3炎癥小體激活的調節[14]。我們之前的研究發現，膿毒癥可導致心肌成纖維細胞中NLRP3炎癥小體的激活[8, 10]，來自心肌成纖維細胞的IL-1β經心肌成纖維細胞-心肌細胞相互作用，引起膿毒癥誘導的心肌細胞凋亡和心肌功能障礙。在本研究中，我們進一步發現脂多糖可引起心肌成纖維細胞中mtROS生成增加，mtROS增加又通過促進細胞內NLRP3和ASC蛋白的結合激活NLRP3炎癥小體，而通過減少激活階段的mtROS可抑制NLRP3炎癥小體的激活和心肌成纖維細胞分泌IL-1β。

NLRP3炎癥小體為細胞內的多蛋白平臺，其激活經引發和激活兩個階段。在引發階段，刺激因素通過NF-κB途徑，增加了細胞內Pro-IL-1β和NLRP3蛋白水平，但并不會影響ASC和Pro-caspase-1的細胞內水平。而激活階段，刺激物引發NLRP3蛋白的NACHT結構域發生自身寡聚化，從而連接蛋白ASC與Pro-caspase-1，引發相互作用。NLRP3炎癥小體復合物通過切割Pro-caspase-1使其活化，活化的caspase-1再將Pro-IL-1β和Pro-IL-18切割，引起IL-1β和IL-18成熟和釋放[7]。我們的研究結果表明，在膿毒癥中mtROS在NLRP3炎癥小體激活中起到關鍵作用，其通過促進NLRP3蛋白和ASC蛋白的結合引發NLRP3炎癥小體的激活。而在激活階段使用mito-TEMPO可有效降低細胞內mtROS的含量，從而可進一步抑制炎癥小體的激活。

但本研究尚不能確定mtROS是通過何種方式來促進NLRP3-ASC蛋白連接，或是否存在其他途徑促進心肌成纖維細胞NLRP3炎癥小體激活。本研究結果表明mtROS在心肌成纖維細胞NLRP3炎癥小體激活中起到重要作用，可能是治療膿毒癥誘發的心肌功能障礙的潛在靶點。