用3AB-ELISA鑒別豬口蹄疫病毒感染與疫苗免疫豬的研究

摘? 要：選擇大腸埃希氏菌口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）與3AB多肽非結(jié)構(gòu)蛋白為主要抗原物質(zhì)，選擇過(guò)氧化氫-四甲基聯(lián)苯胺為底物溶液，以A-G蛋白-辣根過(guò)氧化物酶為酶結(jié)合物質(zhì)，對(duì)豬口蹄疫病毒感染和疫苗免疫豬進(jìn)行3AB-ELISA鑒別試驗(yàn)。采用相關(guān)試驗(yàn)方法對(duì)采集自健康豬、人工感染FMDV的豬和FMD疫苗免疫豬的867份血清進(jìn)行檢測(cè)，3AB-ELISA對(duì)健康豬血清檢測(cè)的特異性為97.63%，對(duì)疫苗免疫豬血清檢測(cè)的特異性為98.90%，由此表明使用3AB-ELISA方法鑒別FMDV感染豬和疫苗免疫豬的效果佳，用3AB-ELISA來(lái)鑒別豬FMDV感染和疫苗免疫豬相較于VIAA-AGID檢驗(yàn)法檢測(cè)效率高，且操作過(guò)程以及方法更為簡(jiǎn)單，是有效的鑒別方法。

關(guān)鍵詞：3AB-ELISA;口蹄疫病毒;I-ELISA;疫苗免疫豬

中圖分類(lèi)號(hào)：S851.34 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2020）03-0038-02

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD）為動(dòng)物A類(lèi)烈性傳染疾病，主要侵害偶蹄動(dòng)物。如果動(dòng)物受到感染，必然會(huì)嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展、農(nóng)產(chǎn)品的銷(xiāo)售以及養(yǎng)殖人員的經(jīng)濟(jì)收入，甚至還會(huì)影響國(guó)家經(jīng)濟(jì)、國(guó)民生計(jì)和人民的健康[1]?？谔阋卟《荆‵oot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，已知共有7個(gè)血清型。最容易感染FMDV的動(dòng)物包括豬、牛和駱駝等，F(xiàn)MDV非結(jié)構(gòu)蛋白（Non Structural Protein，NSP）特異性抗體一般被用來(lái)證明宿主已經(jīng)受到感染或者正在遭受感染[2]，且非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）與結(jié)構(gòu)蛋白不同，不存在血清類(lèi)型的區(qū)別。根據(jù)曾發(fā)表過(guò)的動(dòng)物感染FMDV和免疫鑒別結(jié)果，3ABC抗原作用于抗原的效果顯著，但一些針對(duì)牛的檢測(cè)結(jié)果表明，小部分免疫動(dòng)物出現(xiàn)3A抗體，這很有可能是因?yàn)橐呙缰谱鲿r(shí)殘留了極少量的3A蛋白，從而一定程度上影響了3ABC和3AB檢測(cè)的特異性。I-ELISA使用FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）3ABC多肽為主要抗原物體，能鑒別FMDV抗體和接種滅活疫苗后產(chǎn)生的免疫抗體的效果值得肯定，但是用此種方法檢測(cè)豬血清的特異性相對(duì)較低。白銀市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所建造了一種新型3AB多肽，和3ABC多肽I-ELISA相比對(duì)牛血清檢測(cè)的敏感性差異較小，同時(shí)提高了豬血清的敏感度。

1? 材料和方法

1.1 材料

選擇VDPro FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）抗體檢測(cè)試劑盒，試劑盒中有：FMDV及NSP蛋白包被板（FMDV 3AB Coated Plate）5塊，HRP酶標(biāo)抗體（HRPO Anti-FMDV NSP Conjugate）70 mL，H2O2-TMB底物液（TMB substrate）70 mL，抗原物FMDV-3AB多肽和H2SO4終止液各1瓶。

1.2 待檢豬血清

1.2.1 經(jīng)過(guò)檢測(cè)合格的豬血清

從近段時(shí)間以來(lái)從未出現(xiàn)過(guò)口蹄疫疫情且從未采取免疫措施的地區(qū)收集健康豬血液樣本396份，其中243份來(lái)自FMDV抗體為陰性的健康豬，153份樣本來(lái)自之前接種過(guò)疫苗的健康豬。健康豬血進(jìn)行血清分離，試驗(yàn)時(shí)選用ELISA對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 人工感染FMDV豬血清

選擇體質(zhì)合格的18頭健康豬，用FMDV對(duì)其進(jìn)行人工感染，約半年后采集血液，采血樣本為18份，隨后進(jìn)行血清分離。

1.2.3 FMDV免疫豬血清

選擇453頭FMDV抗體檢測(cè)陰性的豬接種FMDV滅活疫苗，免疫后30 d～60 d采集血液樣本，隨后進(jìn)行血清分離。

1.3 檢測(cè)

1.3.1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備

根據(jù)試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，試劑盒需儲(chǔ)存于2 ℃～8 ℃的環(huán)境中。試驗(yàn)前將洗液稀釋10倍，如洗液20 mL，則需加入180 mL離子水;準(zhǔn)備TMB底物，由于低溫會(huì)降低顯色程度，在使用前將其恢復(fù)到室溫。

1.3.2 檢測(cè)過(guò)程

保證試劑盒中的所有組件的溫度均已恢復(fù)到室溫（22 ℃～28 ℃），取出試劑盒中的抗原包被板;對(duì)樣本、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照做好標(biāo)記，兩種對(duì)照標(biāo)記均做兩孔，每孔倒入稀釋液約80 μL，之后分別倒入20 μL血清、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，搖晃混勻，于室溫環(huán)境下放置1 h，洗凈控干;倒入100 μL酶標(biāo)抗體混合物，于室溫環(huán)境下放置1 h，洗凈控干;倒入100 μL底物反應(yīng)液，于室溫環(huán)境下放置1 h，洗凈控干，倒入100 μL終止液。

2? 結(jié)果

2.1 健康豬血清

用3AB-ELISA法檢測(cè)396份檢驗(yàn)合格的健康豬血清，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，3AB-ELISA的抗體臨界值為0.339。在396份健康豬血清樣本中，9份豬血清的OD450 nm值不在臨界值內(nèi)，占全部健康豬血清的2.27%，用3AB-ELISA法檢測(cè)健康豬血清的特異性是97.63%。

2.2 人工感染豬血清

用3AB-ELISA法檢測(cè)18份人工感染豬的血清，OD450 nm值為0.911±0.293。

2.3 FMDV免疫豬血清

用3AB-ELISA法檢測(cè)453份免疫豬的血清，OD450 nm值是0.174，臨界值0.381。在453份免疫豬血清樣本中，5份豬血清的OD450 nm值不在臨界值內(nèi)，占全部免疫豬血清的1.10%，使用3AB-ELISA法對(duì)FMDV免疫豬血清檢測(cè)的特異性是98.90%。

3? 結(jié)論

用3AB-ELISA法檢測(cè)易受FMDV感染的豬的血清鑒別效果較好，可用來(lái)鑒別動(dòng)物的感染程度和是否受到感染情況。每次試驗(yàn)需做好2孔陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。使用3AB-ELISA法進(jìn)行檢測(cè)鑒別時(shí)，在排除材料的非特異性情況下[3]，如果OD450 nm值≥0.40，則證明FMDV感染，在對(duì)偶蹄動(dòng)物進(jìn)行檢疫時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格選取OD450 nm值<0.376檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢疫。

參考文獻(xiàn)：（3篇;略）

作者簡(jiǎn)介：馬嬌莉（1988.12- ），女，甘肅靖遠(yuǎn)人，本科，助理獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣和動(dòng)物疫病防控與動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督工作