利用CRISPR/Cas9敲除大麥靶基因

(摘譯)

(1.貴陽市花溪第一中學， 貴陽 550025； 2.貴州大學農學院， 貴陽 550025)

1 前 言

自CRISPR/Cas9首次在植物中應用以來，在幾乎所有已實驗物種中都是有效的[1-4]。植物中常用它在特定位點引入雙鏈斷裂(DSB)，再由宿主細胞的非同源末端連接(NHEJ)機制修復，從而導致一些核苷酸插入或缺失，若這些核苷酸位于靶基因編碼區，可能造成功能喪失[5]。

化膿鏈球菌的Cas 9是一種RNA引導的核酸內切酶，與CRISPR(成簇規律間隔的短回文重復序列)II型適應性免疫系統有關[6]；該細菌利用Cas 9/gRNA復合物識別并切割外來DNA。gRNA由兩個獨立的RNA分子組成，它們先雜交然后再與Cas 9結合；2個RNA分子已經成功作為基因組編輯的單鏈向導RNA(sgRNA)[7]。通過剪切sgRNA的5′端(前間隔序列)，使其與靶位點互補，并為Cas 9加上核定位信號，可以在植物或其它真核基因組的特定位點引入DSB。

sgRNA靶點特異的5′端前間隔序列只有20個核苷酸，不論什么靶位點，它的其余部分都是一樣的(圖1)。Cas 9/sgRNA復合體能夠查詢基因組序列，并在匹配處引入DSB。sgRNA功能的關鍵決定因素是同源基因組序列是否緊接NGG，其通常被稱為原間隔基序(Protospacer adjacent motif，PAM)。如果在基因組中發現23個堿基序列(20個來自sgRNA和PAM)，那么核酸內切酶將切割DNA。在高等真核植物中，最主要的修復機制是NHEJ，盡管許多修復將完全恢復至野生型，但有些修復將導致核苷酸的缺失或插入。

由于負責靶向的sgRNA長度較短，難以確保該序列(尤其較大基因組中)不存在其它脫靶位點。脫靶位點和原型間隔區之間錯配，也會導致脫靶突變[5]。使用這23個核苷酸序列(Protospacer和PAM)進行BLAST搜索大麥基因組，及利用其它CRISPR/Cas9在線專用工具盡可能降低脫靶現象。

使用根癌農桿菌攜帶的T-DNA穩定轉化大麥是一個有效方法[8]。使用4個轉錄盒(1個抗潮霉素盒、1個Cas 9核定位表達盒、2個小麥U 6啟動子驅動靶點特異性sgRNA轉錄盒)，及將含T-DNA雙元載體的農桿菌接種未成熟胚可以引入CRISPR/Cas9靶點突變；發現只有部分sgRNA是有效的，且誘變效率因sgRNA不同存在很大差異。為了篩選有效的sgRNAs投入了大量工作[9，10]，這雖然與哺乳動物基因組有關，但可能很好地應用于轉基因大麥。所以，為了使所需轉基因系數量最小化，優選含一對sgRNA的雙元載體。

每個靶基因含2個雙元sgRNA載體，每個載體含一對特異sgRNA，每個靶基因總共有4個sgRNA。即使效率最低情況下，只1/4 sgRNA具有功能，目前已全部完成了15個靶基因的敲除。在許多情況下，2、3或4個sgRNAs具有活性。使用雙元sgRNA載體的另一個潛在優勢是若2個sgRNAs都有活性，通常會刪除整個序列[11]，如整個外顯子。

注：(A)Cas 9/sgRNA復合物在染色體DNA上定位目標序列。sgRNA(黑體字母)5′端的20個核苷酸(前間隔序列)與染色體的上鏈互補，后面緊接著的是PAM，可使Cas 9產生DSB。無論什么靶序列，sgRNA的非可變部分(鏤空字母)都保持不變。(B)DSB由NHEJ機制修復，導致較小的插入和缺失。

對于每個雙元載體，通常做20個轉基因系；然后，篩選T0系是否存在靶突變，從T0靶突變系獲得T1代。播種T1代種子，由于基因分離，可能在T1株系出現丟失了T-DNA的靶突變體。T1代也可能分離出在T0親本所得到的多種突變體，因此在T1代有可能獲得非轉基因的純合突變體。

植物中突變體篩選有多種方法，比如，限制性內切酶/PCR法[12]。然而，發現將靶位點PCR擴增子直接測序是一種快速、簡單且能輸出詳細信息的方法。Cas 9直接切割5′端與PAM間的20個堿基靶序列。如果存在插入或缺失序列，可能導致功能喪失，測序圖譜通常由此切點變成雙峰或三重峰(而野生型則是單峰)。另外，雙元sgRNA的2個sgRNAs都具有活性，且同時切割2個靶位點獲得較短的PCR擴增子(約2個靶點之間的距離)；與野生型相比，可以通過瓊脂糖凝膠上條帶遷移率很容易鑒別片段大小的差異。

將含有插入或缺失突變的T0系保存，種植留種。插入片段應與T-DNA分離，每個靶基因選取4個T0系進入T1，每株系播種24株(共96株)，鑒定出大量無T-DNA的突變體。通過PCR鑒定不含T-DNA的T1植株，并可使用與T0相同的PCR/測序方法篩選無T-DNA、理想的純合突變體。

當T-DNA以孟德爾方式從T1植株中分離時，靶突變通常不會丟失。若編輯發生在T0早期(如再生植物的原始細胞)，T1突變率可達100%；若編輯發生在T0后期，突變效果不如早期，在1個基因座上可能含2個以上等位基因。

2 材 料

2.1 目標序列選擇

可在Deskgen.com、http://plants.ensembl.org/ndex.html、https://ics.hutton.ac.uk/morexGenes/blast_page.html等網站搜索序列。

表1 sgRNA靶點特異性寡核苷酸模板

注：黑體代表限制酶位點的黏性末端。示例中PAM靶序列用下劃線表示。

2.2 表達載體構建

寡核苷酸、引物、質粒、Bsa1、T 4連接酶、PCR儀、電感受態細胞、2 mm電穿孔試管、BioRad基因脈沖器Ⅱ、羧芐青霉素、IPTG、X-gal、質粒提取試劑盒、BigDye?循環測序試劑盒、Esp3I和BpiI、大觀霉素、固體LB培養基、雜交緩沖液等。

2.3 大麥基因組DNA提取

緩沖液1(pH 7.5的Tris HCl 200 mM，250 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5%SDS)，pH 8的Tris-EDTA(TE)等。

2.4 靶位點PCR擴增和測序

2×PCR混合物、PCR儀、引物、瓊脂糖、10×TBE凝膠緩沖液、堿性磷酸酶(1 u/μL，65 ℃加熱滅活)、外切核酸酶Ⅰ(10 u/μL，80 ℃加熱滅活)等。

2.5 非轉基因突變株鑒定

微孔帶、2×PCR混合物、引物、PCR儀、DNA marker等。

3 方 法

3.1 大麥基因組靶序列選擇

1) 在靶基因第一個外顯子鑒別唯一的23 bp核苷酸序列，該序列應符合GN 20 GG模板，并且可以出現在正義鏈或反義鏈上。檢查潛在的脫靶位點，以確保特異性突變。

2) 當4個靶基因檢測了4個靶位點時，使用提取的基因組DNA模板設計和測試覆蓋靶位點的PCR擴增子。PCR能擴增清晰的單一條帶，純化后直接測序得到覆蓋靶區域的色譜圖。

3) 若步驟2已完成，開始構建表達載體；若步驟2尚未完成，可在不同的區域或外顯子中選擇不同的靶序列。

3.2 表達載體構建

1) 使用限制性內切酶Bsa1或Esp3I克隆2個互補的寡核苷酸，向位置3或位置4引導受體添加1個合適的前間隔序列。按表1設計寡核苷酸序列(不包括PAM)。

2) 互補寡核苷酸中加2μM雜交緩沖液，95 ℃保持3 min進行雜交，然后自然冷卻至室溫。

3) PCR體系：100 ng位置3或位置4受體，1μL雜交的寡核苷酸對，1μL 10×T 4連接酶緩沖液，0.5μLBsa1或Esp3I，1μL T 4連接酶，加水至10μL。混合物進行如下循環:37 ℃，20 s；37 ℃，3 min，16 ℃，4 min，26個循環；50 ℃，5 min；80 ℃，5 min。

4) 將1μL混合物轉化大腸桿菌感受態細胞，接種至含100 mg/L羧芐青霉素、0.1 mM IPTG，200μg/mL X-gal的LB瓊脂培養基上37 ℃過夜培養。約選3個白色菌斑分別在含羧芐青霉素的10 mL LB液體培養基中37 ℃培養過夜；提取質粒DNA，并對質粒進行測序，檢測寡核苷酸對是否被正確重組。體系包含200 ng質粒、1.5μL BigDye 3.1緩沖液、1μL 10μM引物、1μL BigDye 3.1，加水至6.5μL。進行如下循環：96 ℃，1 min；96 ℃，10 s，50 ℃，5 s，25個循環；60 ℃，4 min。結合位點周圍的序列如下，轉錄的第1個堿基是從5′端G直接到NX 19，Ns表示原型間隔區序列，3′端的G表示sgRNA的非可變區段的開始。

5′-GCTTGCTGCATCAGACTTG(NX 19)GTTTTAGAG-3′

5) 完整的二元sgRNA載體轉化農桿菌AGL 1菌株，再用以轉入大麥，待T0植株生長14周后，采集葉片提取DNA用于PCR/測序。

3.3 大麥基因組DNA提取

離心管中加入適量葉片，加入600μL緩沖液Ⅰ進行研磨，離心10 min后取上清液，加入等體積丙二醇，離心20 min后，加入0.5 mL 70%乙醇洗滌沉淀，再次離心10 min，棄上清，沉淀風干后溶解于100μL的TE中。

3.4 PCR和靶位點測序

1) 在http://bioinfo.ut.ee/primer 3-0.4.0/primer 3/上設計引物，用野生型DNA進行檢測和優化，以獲得清晰的特異擴增產物。

2) 添加1μL基因組DNA，終濃度150 nM的引物，2×PCR混合物，20μL反應體系進行PCR擴增。

3) PCR擴增結束后，取5μL進行電泳檢測。大片段缺失突變體比野生型的條帶下移。

4) 15μL PCR產物加入1μL堿性磷酸酶(熱滅活)和1μL外切核酸酶Ⅰ(熱滅活)，37 ℃保持30 min后，80 ℃保持20 min；經PCR擴增后，送公司測序，將返回ABI文件供色譜檢查。

5) 靶位點處的片段插入或缺失可能從預期Cas 9切割點附近開始出現雙峰。

6) 播種突變體的T0系種子，在T1代繼續檢測突變體。

3.5 非轉基因突變系鑒定

1) 把每個T0株系收獲的40粒種子置于培養皿中潮濕濾紙上，4 ℃保存2 d后，放在24 ℃光照培養；種子發芽后(約4 d)移至大麥生長基質(2∶2∶1堆肥∶珍珠巖∶砂礫)，白天15 ℃，夜間12 ℃，相對濕度80%，500μmoL/(m2·s-1)光照下培養，生長約1周后，提取葉片DNA。

2) 采用PCR/測序(方法同上)檢測插入或較大片段缺失突變體。這次由于染色體分離，很可能檢測到純合突變體。

3) 用含HptII編碼序列的特異引物進行PCR擴增，以檢測T-DNA是否存在。取5μL PCR產物，當T-DNA存在時，將擴增107 bp的單一條帶，即T1系含轉基因；不含T-DNA但含靶點突變的T1系則為非轉基因突變體。此階段大多為純合突變，若僅鑒定出雜合突變或雙等位突變，則需進入下一輪篩選。