鈣離子脅迫條件下苦蕎種質資源多樣性分析

肖 雪， 章潔瓊2， 陳玉琳， 陳慶富， 朱麗偉， 霍冬敖

(1.貴州師范大學，生命科學學院，求是學院，苦蕎產業技術研究中心， 貴陽 550025;2.貴州省農作物技術推廣總站， 貴陽 550001)

中國西南喀斯特地區以貴州省為中心，該地區是喀斯特地貌分布面積大、發育最典型的片區之一，約占我國喀斯特地區總面積的27%[1]。在自然地理環境中，流水溶蝕石灰巖的基礎上外界機械運動形成了獨特的喀斯特地貌[2]。喀斯特環境是一個極其特殊的環境系統[3-5]：生境中的基巖多為可溶性碳酸鹽巖類，并隨著石漠化程度增加，土壤中鈣離子呈現正相關，其鈣含量約為酸性土壤的3倍[6-7]。鈣離子是植物生長發育中必需的礦質元素之一[8]。種子萌發過程中，鈣離子通過改變酶活性，進而影響種子萌發速率，但不同植物種子萌發對于鈣離子濃度響應不一[9]。

苦蕎是雙子葉蓼科(Polygonaceae)苦蕎屬(FagopyrumMill)植物。中國是苦蕎的起源地和多樣性中心，有著豐富的野生資源和栽培品系[10]。苦蕎因其獨特的抗旱耐瘠、營養均衡，已成為中西部生態脆弱地區重要的糧經作物[11-12]。近年來，隨著我國城鎮化率飛速攀升，土地資源無節制開發侵占了耕地資源，脆弱的喀斯特地區農業面臨直接威脅。因此，篩選耐受高濃度鈣離子苦蕎基因資源，對脆弱地區生態保護有著重要意義。

本研究以不同來源地的苦蕎資源為研究對象，通過設置不同的鈣離子濃度，觀察苦蕎種子萌發情況，探究適宜苦蕎種子萌發的鈣離子濃度，為喀斯特等高富集鈣離子地區栽種適宜苦蕎品系提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所采用的材料來源于5省份共計30份苦蕎資源(表3)。

1.2 試驗方法：

1.2.1試驗設計

試驗共設置3個鈣離子濃度處理，每重復50粒種子，每處理重復2次。采用無水氯化鈣配置鈣離子溶液，濃度梯度設置為0，0.075，0.15 mol/L。

1.2.2種子萌發試驗

挑選大小一致、健康飽滿的苦蕎種子，用濃度為1%的次氯酸鈉消毒，蒸餾水清洗3～4次后置于鋪有2層濾紙的培養皿(直徑為9 cm)中，每皿50粒；將上述處理后的種子置于人工培養箱中培養(溫度：25 ℃，光照：16 h光照、8 h黑暗)；24 h后記錄種子的萌發數(以胚根突破種皮為標準，記錄露白粒數)；每天觀察情況，直到第5天(每天補充適量溶液)。

1.2.3種子萌發參數的統計

依據苦蕎種子萌發特點，借助種子萌發特性分析軟件包GERMINATOR[13]中的方法，推算出5個與種子萌發相關指標2 dGR、5 dGR、GI、AUC、T 50，衡量種子發芽特性。其中：

2 dGR：發芽勢(%)=(2 d內正常發芽的種子數/每皿總種子數)×100%；

5 dGR：發芽率(%)=(5 d內正常發芽的種子數/每皿總種子數)×100%；

GI：發芽指數=Σ(Gt/Dt)，Dt是發芽日數，Gt為第t天的發芽種子數；

AUC(發芽曲線下面積)：將1～5 d的值連接起來，看覆蓋的面積，作為生活力指標；

T 50：發芽率達到50%所需要的時間。

1.3 數據分析

試驗采用Microsoft Excel 2016軟件和SPSS 20.0軟件進行數據處理和統計分析。運用R 3.6.3統計軟件(https://www.R-project.org/)基于離差平方和法(Ward)的聚類分析。

2 結果與分析

2.1 鈣對苦蕎種子萌發的影響

不同鈣離子濃度處理下，30種苦蕎品系種子萌發參數不盡相同(圖1)。苦蕎發芽勢隨鈣離子濃度的增加呈先升后降的趨勢。鈣離子濃度0 mol/L時，發芽勢均值為(73.23±10.16)%，當鈣離子濃度達到0.075 mol/L時，發芽勢快速上升，均值達到(89.27±6.03)%，與0 mol/L時發芽勢相比，差異達顯著水平。鈣離子濃度0.15 mol/L時，發芽勢快速下降，均值僅為(47.60±18.73)%。發芽率、發芽指數以及AUC(發芽曲線下面積)參數與發芽勢表現出相同趨勢。其中AUC指的是將種子萌發1～5 d的值連接起來，所覆蓋的面積，該指標可以判定種子的生活力，當鈣離子濃度為0.075 mol/L時，AUC均值為(86.93±5.76)%，與鈣離子濃度0 mol/L以及0.15 mol/L時相比，AUC參數顯著提高。T 50可以衡量種子萌發的一致性。鈣離子濃度0.15 mol/L時，T 50均值為(48.65±8.53)h，而當鈣離子濃度為0 mol/L和0.075 mol/L時，該參數均值分別為(41.10±4.00)h和(28.80±5.17)h，差異分別達顯著。

2.2 苦蕎種子萌發參數相關性分析

由表1可知，5個萌發參數均呈極顯著相關。其中發芽勢、發芽率、發芽指數和AUC成正相關，T 50與這4個參數負相關。

2.3 苦蕎耐鈣極端種質的初步篩選

綜合苦蕎萌發參數對30份苦蕎種質進行聚類分析，并針對不同類群進行萌發參數方差分析(表2)。在鈣離子濃度0 mol/L時，苦蕎種質劃分為3個大類群(圖2)，類群間在發芽勢、發芽率、發芽指數、AUC和T 50均存在差異(表2)。鈣離子濃度0.075 mol/L時，苦蕎種質劃分為3個大類群(圖3)，類群間在萌發參數存在差異。其中Ca-0.075-II群種質對于低濃度鈣離子響應比較靈敏，發芽指數、AUC和T 50與對照相比有顯著提升。鈣離子濃度0.15 mol/L時，苦蕎種質同樣劃分為3個大類群，類群間在發芽勢、發芽率、發芽指數、AUC和T 50均存在差異(圖4)。在高鈣離子濃度地區，萌發受到影響，但Ca-0.15-II群種質對響應較不敏感，相對萌發參數表現良好。

表1 鈣脅迫下苦蕎種子萌發參數的相關性分析

注：***:在0.001水平上極顯著相關。

表2 不同濃度鈣離子處理下苦蕎種質聚類分析和萌發參數的差異分析

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

3 討 論

在我國中西部喀斯特生態脆弱地區，苦蕎因其適應性極強，且富含氨基酸以及生物黃酮類物質，具有極高的營養價值，已逐漸成為出口糧食之一[14]。芽菜苦蕎不涉及深加工過程，能最大限度保存營養物質且風味獨特[15]，但苦蕎種子萌發過程中，存在著種子發芽率低、萌發一致性差等諸多因素，限制了芽菜苦蕎的進一步推廣。

3.1 鈣離子脅迫對苦蕎種子萌發的影響

本試驗研究表明，苦蕎種子發芽勢、發芽率、發芽指數和AUC參數均隨鈣離子濃度的增加表現出現先升后降的趨勢。環境鈣離子濃度較高時，外界較低的水勢脅迫種子吸水困難，呼吸作用受到抑制，進而導致種子萌發率降低[16]。這與李永濤等[17]和蔡喜悅等[7]的研究結果相一致。而呂朝燕等[18]研究表明，低濃度鈣離子脅迫可以顯著提高紫花苜蓿種子發芽率。劉小麗等[19]通過不同鈣離子濃度對香椿種子萌發因素進行研究表明，低鈣離子處理同樣可以促進種子的發芽指數、活力指數等顯著提升。本研究發現，總體上低濃度鈣離子對苦蕎種子萌發具有促進作用，高濃度鈣離子脅迫對苦蕎種子萌發起到抑制作用。

3.2 基于復合萌發參數對苦蕎芽菜選育

為篩選出耐受喀斯特區域高濃度鈣離子苦蕎種質資源和苦蕎芽菜最優品系，基于種子萌發的5個指標參數將30份苦蕎品系進行聚類分析，類群間的方差分析揭示：在鈣離子濃度0.075 mol/L時，苦蕎Ca-0.075-III群6個品系具有較高的發芽指數、AUC，T 50數值最小，表明這些品系可以作為高種子發芽率、一致性芽菜推薦品系。而在鈣離子濃度0.15 mol/L時，Ca-0.15-II群13個品系具有較高的萌發率，可以作為喀斯特高鈣區域選育材料進行優系選育。

表3 苦蕎種質資源名稱及產地