血流感染肺炎克雷伯菌毒力基因分布及與CRISPR-CAS系統相關性研究

宋國濱，王 剛，黃 穎，徐元宏

肺炎克雷伯菌由于最近幾年對臨床常用抗生素的耐藥率呈現大幅度增長，已經躍居為院內感染的第二大致病菌，引起臨床醫師、臨床微生物實驗室醫務工作者的高度重視[1]。除耐藥率越來越高的特點外，其毒力基因同樣受到廣大醫務工作者及科研工作者的關注，從1986年，Liu et al[2]報道了肺炎克雷伯菌導致的原發性侵襲性肝膿腫，伴有轉移性眼內炎病例以來，越來越多的病例在國內外很多醫療機構都有報道，因其具有高毒力性、高致病性，有學者[3]將其稱為高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKP)，其細胞壁結構具有豐富的莢膜多糖導致菌落呈現高黏液表型，可以抵抗中性粒細胞對其的殺傷作用，并可借助中性粒細胞向遠處轉移，引起眼部和中樞神經系統感染[4]。尤其肺炎克雷伯菌引起的血流感染，導致的敗血癥極易增加患者的住院時間，引起患者的死亡。成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)及其相關序列(CRISPR associated sequences, CAS)組成的CRISPR-CAS系統廣泛存在于古細菌和細菌中，是近30年發現的天然的適應性免疫調節系統[5]。該研究著重探討分離于安徽醫科大學第一附屬醫院血流感染陽性的肺炎克雷伯菌的莢膜血清型、毒力相關基因的分布情況，以及與CRISPR-CAS系統的相關性，以便更好地闡明兩者之間的關系，有助于為臨床防控感染以及研究毒力基因的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及鑒定收集安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科2018年1月～2019年1月保存的血流感染陽性非重復肺炎克雷伯菌，采用基質輔助激光解吸電離飛行質譜(MALDI-TOF MS)重新鑒定，質譜鑒定質控菌株大腸埃希菌8739及實驗質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603為本實驗室所保存。

1.2 儀器與試劑高速冷凍離心機(中國heal force公司)；GeneAmp970基因擴增儀(美國PE公司)；C-880V CO2孵箱、紫外線凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；VITEK MS質譜儀(法國生物梅里埃公司)。抗菌藥物(英國OXOID公司)；瓊脂糖、引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；標志物DNA Marker、Premix TaqTM(日本TaKaRa公司)；VITEK MS CHCA基質液(法國生物梅里埃公司)；哥倫比亞血平板(合肥天達診斷試劑有限公司)；藥敏試驗培養基為Muller-Hinton瓊脂(江門市凱林貿易有限公司)。

1.3 藥物敏感試驗采用vitek-compact2儀器及紙片擴散法對肺炎克雷伯菌進行藥敏試驗。

1.4 高黏液表型篩選將菌株復蘇接種于血平板上，在培養箱孵育22 h后，用接種環挑取單個菌落，拉絲實驗的黏液絲≥5 mm為陽性[6]。

1.5 PCR檢測莢膜血清型、毒力基因將菌株接種于哥倫比亞血平板上，置于37 ℃溫箱中孵育18～22 h，挑取4～5個單菌落置于500 μl TE緩沖液內，在振蕩器上渦旋震蕩10 s，放于水浴鍋內煮10 min后冰上冷卻5 min，12 000 r/min離心10 min，離心后吸取300 μl上清液轉移到新的EP管內，即為DNA模板。運用PCR擴增K1、K2、K5、K20、K54、K57 6種最常見莢膜血清型和rmpA、aerobactin、alls、Kfu、wcaG、magA、fimH 7種毒力相關基因。其條件為94 ℃預變性30 s，94 ℃變性60 s，50～59 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，經過35個循環后，最后72 ℃延伸10 min。引物序列參考文獻[7-10]、退火溫度及產物大小見表1。

1.6 PCR檢測CRISPR-CAS系統根據參考文獻[11-12]分別擴增CRISPR-1、CRISPR-2、CAS1 3種基因，退火溫度進行梯度摸索，將陽性產物送至上海生工進行測序，將測序結果于網站http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr進行比對，CAS1陽性及CRISPR-1、CRISPR-2兩個基因中至少一個基因陽性代表存在CRISPR-CAS系統，其余基因陽性組合為不存在CRISPR-CAS系統。

表1 6種莢膜血清型和7種毒力基因引物序列

2 結果

2.1 藥物敏感性紙片擴散法和vitek-compact2儀器結果一致。將61株肺炎克雷伯菌分為hvKP和經典肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)2種類型,hvKP對氨芐西林天然耐藥，對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、復方新諾明、亞胺培南、美羅培南、替加環素、多黏菌素B均敏感。cKP對氨芐西林均耐藥，對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、復方新諾明、亞胺培南、美羅培南、替加環素、多黏菌素B的耐藥率分別為48.8%、56.1%、61%、65.9%、63.4%、58.5%、44%、46.3%、41.4%、2.4%、14.6%。

2.2 肺炎克雷伯菌拉絲實驗61株肺炎克雷伯菌經過拉絲實驗共檢出14株陽性菌，檢出率為23%，經PCR檢測14株高黏液型菌株rmpA基因全為陽性，定義為hvKP,其余為cKP。

2.3 莢膜血清型及毒力基因分布情況PCR檢出K1型12株，K2型8株，K5、K20、K57各1株。毒力基因以fimH檢出最多，為60株，檢出率為98.4%，rmpA、aerobactin、alls、Kfu、wcaG、magA分別檢出20、14、6、19、12、12株，檢出率分別為是32.8%、23.0%、9.8%、31.1%、19.7%、19.7%。hvKP與cKP莢膜血清型及毒力基因分布情況見表2，5種莢膜血清型陽性條帶圖見圖1，7種毒力基因條帶圖見圖2。

表2 hvKP與cKP莢膜血清型及毒力基因分布情況[n(%)]

圖1 5種莢膜血清型陽性條帶圖

M:Marker;1、2:K1血清型；3、4:K2血清型；5、6：K5血清型；7、8:K20血清型；9、10：K57血清型

2.4 CRISPR-CAS系統與毒力基因分布相關性經過PCR技術檢測及測序，共篩選出CRISPR-CAS系統陽性菌株為11株，CRISPR-CAS系統陰性為50株，CRISPR-CAS系統陽性菌株中，有9株為hvKP，有5株同時含有rmpA、aerobactn、alls、Kfu、wcaG、magA、fimH。有3株同時含有rmpA、aerobactin、Kfu。1株只含有rmpA、aerobactin 2種基因。除fimH基因外，CRISPR-CAS系統陽性菌株其攜帶毒力基因數量明顯高于CRISPR-CAS系統陰性菌株，經χ2檢驗統計學計算P<0.05，差異有統計學意義。CRISPR-CAS系統與毒力基因相關性見表3。

圖2 7種毒力基因條帶圖

M:Marker;1、2:rmpA基因陽性;3、4:wcaG基因陽性;5、6:aerobactin基因陽性;7、8:Kfu基因陽性;9、10:alls基因陽性;11、12:magA基因陽性;13、14:fimH基因陽性

表3 CRISPR-CAS系統與毒力基因相關性(n)

*采用Fisher確切概率法比較，無χ2值

3 討論

hvKP因其攜帶多個毒力基因，使其呈現高黏液表型，可以抵抗人體內中性粒細胞的殺傷作用，極易引起敗血癥，給患者的健康帶來了嚴重的威脅。hvKP除了可以引起院內感染外，也可引起社區感染，正常青年人同樣可以感染此種類型菌株，并易向眼部和中樞神經系統等位置遠處轉移。

本研究61株肺炎克雷伯菌共篩選出14株hvKP，其對抗生素的耐藥性遠低于普通肺炎克雷伯菌。K1和K2型莢膜血清型在6種血清型中檢出率最高，且最常見、毒力最強[13]，除了在hvKP中檢出到K1型，在cKP中也有檢出到，與李喜紅 等[14]研究一致。rmpA基因是促進肺炎克雷伯菌莢膜多糖合成的調控基因，其編碼的rmpA蛋白可以促進高黏液表型的形成。本研究中，除了14株拉絲實驗陽性菌株rmpA基因陽性，在拉絲實驗陰性的菌株中也檢測到了rmpA基因，說明高黏液表型的形成除了rmpA基因參與調控外，還需要其他毒力基因共同參與。對于很多生物來講，鐵作為一種輔助因子在生化代謝方面，電子傳遞等生命活動過程中起到非常重要的作用，aerobactin基因所編碼產生的鐵載體，可以競爭血液中的鐵離子，促進菌株的生長繁殖，是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子，有研究[15]表明，aerobactin存在可以使菌株的毒力增強100倍，本研究該基因僅存在于14株hvKP中，從側面可以反映出菌株高黏液表型的形成與aerobactin基因的存在密切相關。值得注意的是，本研究中毒力基因fimH基因篩選數量最多，與付方俊 等[16]的研究一致，在hvKP和cKP中并沒有顯著區別，說明該基因并不能成為區分肺炎克雷伯菌的一個標志。magA基因編碼的蛋白可以促進黏液性的形成，并參與莢膜多糖的產生，后來的研究[17]證實該基因僅存在于血清型K1菌株中，本研究結果與之一致，國內也有相關的報道[18]。wcaG基因的編碼產物為胞外多糖的巖藻糖，可以避免被血液中巨噬細胞的吞噬作用所消滅，本研究中該基因也和K1型血清型分布一致，可能和K1血清型基因分布在同一質粒上，是否含有其他的機制，需要進一步研究。其他毒力基因在hvKP中的檢出率明顯高于cKP。

CRISPR-CAS系統是廣泛存在于細菌和古細菌中的一種適應性免疫調節系統，其間隔序列與噬菌體和質粒有很高的同源性，有學者[8]認為該系統可以抵御來源于外界的核酸，經過一系列研究，證實了該系統可以對外源核酸進行切割，具體的過程分為3步：首先在適應性階段，攜帶一個或多個CRISPR基因座的細菌和古生菌通過將外源序列的短片段(原間隔子)整合到宿主染色體CRISPR序列近端對外源病毒和質粒作出反應，在表達和干擾階段，重復間隔子元件轉錄到為前體CRISPR-RNA(pre-crRNA)分子，然后經過酶切產生短的crRNA，可與入侵病毒或質粒的互補原間隔子序列配對,由crRNA識別目標并通過與crRNA結合的CAS蛋白來使外源核酸序列不表達達到清除外源核酸的目的。肺炎克雷伯菌的毒力基因存在于質粒中，有很多文獻研究過其與耐藥性之間的相關性，而與毒力基因之間存在的相關性研究不多，本研究將61株肺炎克雷伯菌分為CRISPR-CAS系統陽性菌株和CRISPR-CAS系統陰性菌株，顯示CRISPR-CAS系統陽性菌株毒力基因攜帶率比CRISPR-CAS系統陰性菌株高，經過χ2檢驗差異有統計學意義，其與質粒或染色體介導的耐藥基因的攜帶率正好相反，本研究中，hvKP除了對氨芐西林天然耐藥外，對臨床常用抗生素均有良好的敏感性，cKP對抗生素的耐藥率較高，可能和由質粒或染色體介導的碳青霉烯酶、超廣譜β-內酰胺酶、頭孢菌素酶的傳播有關，其具體的耐藥機制還應通過相關實驗從分子基因水平進行驗證，另外在細菌的進化過程中，耐藥基因的獲得對細菌的生長起到非常重要的作用，但并不是任何的質粒都能被細菌所接受，仍然需要平衡細菌獲得質粒所需能量與細菌所產能量之間兩者的關系。Palmer et al[19]的研究表明，CRISPR-CAS系統陽性菌株其耐藥率比陰性系統低，本研究通過χ2檢驗經過計算CRISPR-CAS系統與耐藥性之間的相關性，差異無統計學意義，可能與樣本數量少有關，對于質粒介導的毒力基因和CRISPR-CAS系統相關性的分子機制仍需要進一步研究。