不同基因型慢性乙肝患者的耐藥變異位點(diǎn)分析

李淑悅，程 娜，王嘉鑫，肖金平

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染仍然是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，全世界每年大約有超過78萬人死于乙肝相關(guān)性疾病(如肝硬化、原發(fā)性肝細(xì)胞癌)[1]。HBV病毒感染的特點(diǎn)是感染率高、感染人數(shù)眾多、病程長(zhǎng)，目前缺乏特效藥物且難以完全治愈。大面積乙肝疫苗的普及，已經(jīng)使HBV感染率明顯下降[2]，現(xiàn)在人們開始關(guān)注耐藥和徹底清除乙肝病毒問題。近幾十年來，HBV感染的治療藥物主要依賴于干擾素和核苷(酸)類似物(nucleoside/nudeotide analogues，NAs)這兩大類，NAs具有很強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制作用，比基于干擾素的療法更方便并且具有更少的副作用，然而長(zhǎng)期用藥后，一些藥物會(huì)出現(xiàn)病毒學(xué)突破現(xiàn)象。現(xiàn)擬使用直接測(cè)序法對(duì)江西省104例樣本的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)(RT區(qū))行耐藥變異位點(diǎn)檢測(cè)，區(qū)分基因型、篩選正選擇位點(diǎn)，進(jìn)一步分析該地區(qū)慢性乙肝患者耐藥相關(guān)原因，為患者個(gè)體化醫(yī)療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2015～2018年間在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診定期隨訪的慢性乙型病毒性肝炎患者，共計(jì)104例。患者均來自江西省本地區(qū)市、縣，所有診斷符合《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)》[3]。排除HCV、HDV、HIV混合感染，排除酒精性肝病、脂肪肝及自身免疫性肝炎患者。其中男77例，女27例，年齡21～75(43.36±12.47)歲。所有患者均接受了NAs抗病毒治療，療程≥1年。患者每1～6個(gè)月行血清HBV DNA、肝功能檢測(cè)。研究設(shè)計(jì)經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)包括乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、HBV DNA水平。

1.3 應(yīng)答不佳界定抗病毒治療24周，HBV DNA較基線下降幅度>1 log10IU/ml，但仍然可以檢測(cè)到[3]。

1.4 HBV DNA RT區(qū)測(cè)序根據(jù)HBV DNA P基因RT區(qū)的保守序列，應(yīng)用Primer Premire 5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，引物由武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所合成，序列為：外側(cè)正向引物ESP：5′-AGGCCTTATAAGTTGGCGA-3′，反向引物EAP：5′-TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3′；內(nèi)側(cè)正向引物ISP：5′-CY(T/C)TGTATTCCCATCCCATC-3′，反向引物IAP：5′-TGACATACTTTCCAATCA ATAGG-3′，包含大部分目前已知的HBV RT區(qū)核苷酸類似物耐藥變異位點(diǎn)，并利用上述引物構(gòu)建PCR反應(yīng)體系對(duì)目的片段擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增陽性產(chǎn)物由武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所直接測(cè)序。

1.5 基因變異檢測(cè)臨床樣本測(cè)序結(jié)果以NCBI Genotyping 工具中23株基因型為A-H型的HBV全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為參照(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)來確定基因分型。采用BioEdit軟件包(版本7.0.5)進(jìn)行核酸與氨基酸序列的比對(duì)，分析氨基酸的變異。

1.6 選擇壓力分析非同義突變和同義突變的率比ω(ω=dN/dS)是反應(yīng)選擇壓力的重要指標(biāo)。當(dāng)ω>1時(shí)，表明該位點(diǎn)受到正選擇壓力作用，同時(shí)該密碼子被稱為正選擇位點(diǎn)；ω=1或ω<1則分別說明該位點(diǎn)受到中性選擇和純化選擇(即負(fù)選擇)[4]。采用DataMonkey在線軟件(http://www.datamonkey.org/)篩選正選擇位點(diǎn)，Datamonkey由HyPhy執(zhí)行，HyPhy是一種分子進(jìn)化分析平臺(tái)，在計(jì)算機(jī)集群上進(jìn)行并行分析，簡(jiǎn)化且易于使用[5]。Datamonkey篩選正選擇位點(diǎn)的算法主要包括隨機(jī)效應(yīng)似然模型(random effects likelihood model，REL)、固定效應(yīng)似然模型(fixed effects likelihood model，F(xiàn)EL)和單一似然祖先計(jì)數(shù)法(single likelihood ancestor counting，SLAC)[6]。SLAC是運(yùn)行速度最快、同時(shí)也是最保守的算法,適用于分析大型數(shù)據(jù)集(50～150條序列)，能夠重建每個(gè)密碼子位點(diǎn)的替代過程，存在錯(cuò)漏選擇位點(diǎn)的可能，但亦能防止將中性位點(diǎn)誤判為正選擇位點(diǎn)。FEL在統(tǒng)計(jì)性能和計(jì)算工作量之間保持有良好平衡，總體表現(xiàn)屬最佳算法，適用于分析中型或者大型數(shù)據(jù)集(50～100條序列)，也能重建密碼子的替代過程。REL是PAML軟件中基于密碼子進(jìn)行選擇分析這一算法的擴(kuò)展，它允許同義替代率存有差異，因而REL常常是能從小型或者低度分化的序列比對(duì)結(jié)果中檢測(cè)出選擇作用的唯一方法，適用于小型數(shù)據(jù)集(5～15條序列，至多40條)。然而，由于此法所依賴的假設(shè)條件較多，也容易產(chǎn)生假陽性。從各方法的適應(yīng)條件以及出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果等方面綜合考慮，本研究采用FEL方法篩選正選擇位點(diǎn)(P<0.1)。

2 結(jié)果

2.1 挽救治療的療效分析104例患者中B基因型患者為93例， C基因型患者為11例，未檢測(cè)出其他基因型。在兩種不同基因型中性別和年齡方面均無差異(P>0.05)。挽救治療后患者HBV DNA、ALT水平均下降，HBV DNA水平降低更加明顯。但e抗原陰轉(zhuǎn)率、HBV DNA及ALT水平在不同基因型中的無差異(P>0.05)(表1)。

2.2 HBV RT區(qū)主要變異類型及在不同基因型中的分布B基因型和C基因型患者在性別、年齡、耐藥率、HBeAg陽性率、用藥類型方面無差異(表2)。104例患者中87例檢測(cè)出與藥物相關(guān)變異位點(diǎn)，其中14例(13.46%)出現(xiàn)多位點(diǎn)耐藥變異(3個(gè)及以上位點(diǎn))；剩余17例中7例未檢出耐藥變異位點(diǎn)。M204I位點(diǎn)變異率最高，以B基因型為主； M204I+L180M位點(diǎn)變異在C基因型中發(fā)生率高于B基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表1 B基因型及C基因型患者的人口學(xué)及臨床特征 [M(P25，P75 )]

表2 B基因型及C基因型患者人口學(xué)及臨床特征

表3 B基因型及C基因型患者耐藥變異類型[n(%)]

2.3 選擇壓力的分析兩種基因型的選擇壓力均以中性選擇為主，但B基因型中可見正選擇位點(diǎn)(表4)。利用在線DataMonkey軟件，以ω值(dN/dS)>1且P<0.1時(shí)為正選擇點(diǎn)篩選出B基因型中rt207、rt229 為正選擇位點(diǎn), rt169、rt245為負(fù)選擇位點(diǎn)；C基因型中只發(fā)現(xiàn)rt202、rt204、rt245為負(fù)選擇位點(diǎn)(表5、6)。

表4 不同基因型的選擇壓力分析(n)

表5 B基因型序列的選擇位點(diǎn)

LRT:似然比檢驗(yàn)

表6 C基因型序列的選擇位點(diǎn)

3 討論

HBV是一個(gè)部分閉合的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，HBV在復(fù)制過程中依賴逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的前基因組RNA完成，而逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正活性，故是一種具有高變異性的DNA病毒[7-8]。近年來，慢性乙型肝炎的治療取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，以服用NAs為主，但無限期治療會(huì)增加耐藥性發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，在藥物和人體免疫環(huán)境雙重誘導(dǎo)下，HBV RT區(qū)出現(xiàn)了位點(diǎn)突變[9]。目前LAM、LDT出現(xiàn)高耐藥率，慢性乙型肝炎診療指南明確指出可加用ADV,或改用ETV、TDF，隨著各種NAs的廣泛使用，研究[10]表明ETV、ADV、TDF也出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。本研究中104例定期隨訪患者出現(xiàn)耐藥后多選用ETV或TDF進(jìn)行挽救，都表現(xiàn)出良好療效。在不同基因型中，e抗原陰轉(zhuǎn)率、ALT復(fù)常率、e抗原陽性率、耐藥率、用藥類型方面均無差異，但耐藥變異位點(diǎn)A181V+N236T、M204V+L180M+I169T/L+S202G、M204V+L180M+T184A+I169T/L、M204V+L180M+S202G、M204V+L180M+M250L、N236T、S/C256G、S213T、L217F、Q215H、Y/F221H只在B基因型中檢測(cè)到,而M204I+A181T、M204V+L180M+T184I+V137、M204V/I+L180M +V137L只在C基因型中檢測(cè)到；M204I+L180M位點(diǎn)變異率在C基因型中高于B基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HBV RT區(qū)位點(diǎn)突變是多因素綜合影響的結(jié)果，在臨床工作中基因分型及RT區(qū)測(cè)序應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用。

慢性乙肝患者在接受NAs藥物后，來自病毒變異體之間的競(jìng)爭(zhēng)(復(fù)制效率的差異)和/或宿主免疫活性的選擇壓力，使含有耐藥突變的變異株逐漸發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)株，最終導(dǎo)致HBV群耐藥[11-13]。病毒基因突變符合達(dá)爾文進(jìn)化理論——適者生存。對(duì)單一的一種抗病毒藥物而言，病毒群體所面臨的就是一個(gè)針對(duì)特定靶點(diǎn)的具有高度特異性的選擇壓力，當(dāng)一個(gè)基因受到正選擇作用，說明其群體為了適應(yīng)新的環(huán)境，需要提供有利的突變，產(chǎn)生新的基因功能；而當(dāng)一個(gè)基因受到負(fù)選擇作用即此基因保持原有的功能且趨于穩(wěn)定[14]。正選擇位點(diǎn)篩選是研究病毒基因序列進(jìn)化分析的一個(gè)重要方法。RT區(qū)是相對(duì)保守區(qū)，以負(fù)選擇作用為主，在本研究中B基因型患者篩選出正選擇位點(diǎn)rt207、rt229，這兩種基因位點(diǎn)并不包含在常見的耐藥位點(diǎn)中，說明江西省內(nèi)核苷酸類似物的廣范使用，促使新的基因功能出現(xiàn)，并亦可能是出現(xiàn)多個(gè)新耐藥位點(diǎn)的原因，但這兩個(gè)突變位點(diǎn)與哪種藥物耐藥相關(guān)尚未明確，有待進(jìn)一步研究。