脂氧素A4在結核性胸膜纖維化中的表達水平及影響機制初探

朱建坤 孟倩 金鋒

結核性胸膜炎患者出現胸膜纖維化在臨床上比較常見，表現為胸膜增厚，部分形成膿胸包裹，導致胸廓塌陷或肺膨脹不全，治療非常棘手。轉化生長因子β(TGF-β)是促進胸膜纖維化的重要細胞因子之一，而脂氧素A4(LXA4)具有抑制促炎因子的表達，調節免疫應答等作用，并且在肺、結腸、腎等器官中具有抗纖維化的作用[1-3]，但在結核性胸膜纖維化進程中的表達及影響機制尚未有研究。本研究通過檢測61例結核性胸腔積液患者胸腔積液中LXA4的濃度，分析LXA4與結核性胸膜纖維化的關系，并通過研究LXA4與TGF-β的相關性探討LXA4在結核性胸膜纖維化進程中的影響機制。

資料和方法

一、研究資料

(一)患者來源

選擇2017年7月至2018年12月山東大學附屬山東省胸科醫院收治的76例胸腔積液患者。其中，結核性胸腔積液患者61例；男22例，女39例；年齡21～65歲，平均(30.2±4.7)歲。癌性胸腔積液患者15例；男9例，女6例；年齡56～67歲，平均(65.1±3.8)歲。

(二)診斷標準

1. 結核性胸腔積液診斷標準：(1)胸膜活檢發現結核結節；(2)胸腔積液或痰液找到抗酸桿菌；(3)肺部有活動性結核病灶；(4)臨床結核中毒癥狀明顯，胸腔積液呈滲出性改變；(5)經抗結核藥物治療后癥狀好轉，胸腔積液吸收快；(6)經追蹤觀察并排除其他疾病。具備上述診斷標準中3項或3項以上即可確診。

2. 癌性胸腔積液的診斷標準：(1)胸腔積液中查到癌細胞；(2)胸膜活檢或肺活檢病理檢查明確診斷。具備上述診斷標準的任意一項可確診。

3. 分組標準：結核性胸腔積液患者中，胸腔積液為包裹性，胸膜增厚>5 mm者，列入結核性胸膜纖維化組(簡稱“結核纖維化組”)，共27例；無胸膜增厚，或胸膜增厚<5 mm者，列入無結核性胸膜纖維化組(簡稱“結核無纖維化組”)，共34例；癌性胸腔積液患者均無胸膜增厚，共15例，列入癌性無纖維化組。

二、研究方法

1. 標本的收集：所有患者均在B超引導下行胸腔穿刺，抽取胸腔積液20 ml，以10 000×g離心 10 min 后，取上清液置-20 ℃冰箱保存待測。

2. 標本的檢測：LXA4及TGF-β采用標準試劑盒，應用酶聯免疫檢測儀測定?；静襟E包括：(1)包被：用碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/ml。在聚苯乙烯酶標板的每孔加100 μl稀釋后的抗體，4 ℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。(2)封閉：每孔加入200 μl封閉液，37 ℃孵育1～2 h。(3)洗滌：小心揭掉封板膜，放入洗板機，洗滌3～5遍；也可以手動洗板，步驟為：棄去液體，每孔加入300 μl洗液，浸泡1～2 min，在吸水紙上拍干，重復3～5遍。(4)加樣：加適當稀釋的待檢樣品100 μl于上述已包被的反應孔中。(5)溫育：用封板膜封板后置37 ℃孵育1～2 h。(6)洗滌：同步驟3。(7)加抗體：于各孔中加入稀釋好的生物素化抗體工作液100 μl。(8)溫育：用封板膜封板后置37 ℃孵育1 h。(9)洗滌：同步驟3。(10)加酶結合物：于各孔中加稀釋好的酶結合物工作液100 μl。(11)溫育：用封板膜封板后置37 ℃避光孵育30 min。(12)洗滌：同步驟3。(13)加顯色底物：于各孔中加入3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)底物溶液100 μl，37 ℃避光反應10～30 min，直到倍比稀釋的標準品孔出現明顯的顏色梯度為止。(14)終止反應：于各反應孔中加入終止液硫酸100 μl，至顏色由藍色變為黃色為止。(15)結果測定：10 min內，在酶標儀上于450 nm處，以空白對照孔調零后測各孔吸光度(A450)值。

3. 酶聯免疫分析結果：酶聯免疫試劑盒由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。根據試劑盒自帶標準曲線方程，以標準品的濃度和A450制作標準曲線，再根據標準曲線方程計算出樣本濃度。具體操作由武漢賽維爾生物有限公司完成。

三、統計學處理

結 果

結核無纖維化組LXA4濃度為7.74(4.69，10.55) ng/L，明顯低于結核纖維化組[12.50(11.60，14.83) ng/L]，差異有統計學意義(Z=-3.830，P<0.001)。癌性無纖維化組LXA4濃度為7.88(5.91，15.02) ng/L，與結核無纖維化組[7.74(4.69，10.55) ng/L]比較，差異無統計學意義(Z=-0.586，P=0.558)。

以61例結核性胸腔積液患者的LXA4濃度為縱坐標，以TGF-β濃度為橫坐標，繪制散點圖，散點圖顯示兩者之間具有相關性。正態性檢驗顯示兩變量均呈偏態分布，Spearman相關系數檢驗顯示，LXA4濃度[10.23(5.14，13.15) ng/L]與TGF-β濃度[46.30(41.04，60.85) ng/L]呈負相關性(rs=-0.519，P<0.001)。見圖1。

圖1 61例結核性胸腔積液患者LXA4與TGF-β濃度散點圖

討 論

LXA4為花生四烯酸代謝產物，廣泛存在于單核細胞、多形核白細胞、氣道上皮細胞和血管內皮細胞中，通過抑制中性粒細胞在炎性反應部位的聚集，調節促炎、抗炎因子的平衡，限制炎性反應損傷，調節組織修復，促進單核巨噬細胞的趨化和巨噬細胞對凋亡中性粒細胞的清除等，發揮抗炎及促進炎癥消退的作用。在內毒素肺損傷、腎小球腎炎、哮喘、腹膜炎等多種與炎癥有關的疾病模型中，脂氧素促進炎癥消退的作用都得到了證實[4]。吳志軍和鄒海[5]報道，在結核性胸膜炎患者中，外周血和胸腔積液中的LXA4明顯升高，且與結核病病情控制情況相關，認為LXA4可抑制腫瘤壞死因子α、白細胞介素1等促炎因子的表達及調節免疫應答，可作為結核性胸膜炎治療效果的評價指標。在本研究中，結核無纖維化組與癌性無纖維化組患者胸腔積液中LXA4濃度差異無統計學意義，但結核纖維化組患者的LXA4濃度明顯高于結核無纖維化組患者，證實LXA4參與了結核性胸膜炎胸膜纖維化反應，并且其水平與胸膜纖維化程度相關。

LXA4通過分布于肺、肝、脾、腸道等器官的受體細胞，如中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞、成纖維細胞等，在肺、結腸、腎等器官中具有抗纖維化的作用。LAX4通過抑制細胞因子信號傳導抑制蛋白(SOCS)調節Janus激酶(JAK)/信號轉導和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信號通路(JAK/STAT信號通路)，緩解腎臟的纖維化，而阻斷TGF-β及其下游Smad3(細胞內重要的TGF-β信號轉導及調節分子)信號通路，被認為是LXA4抗結腸纖維化作用的機制之一[2]。在博萊霉素誘導肺纖維化的小鼠模型中，注射博來霉素并同時注射脂氧素(lipoxins，LXs)可使肺組織炎性細胞浸潤及水腫明顯減輕，肺泡數量增多，細胞外基質沉淀減少，證明 LXA4有減輕并逆轉肺纖維化的作用，還可以拮抗結締組織生長因子(CTGF)誘導的信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)與DNA結合的活性，緩解肺纖維化的進程[6]。

關于LXA4的抗纖維化作用是否在結核性胸膜炎患者中同樣適用，本研究發現，61例結核性胸腔積液患者LXA4與TGF-β的相關性分析結果顯示，LXA4與TGF-β呈現明顯負相關性。而TGF-β已被證實在胸膜纖維化中起著重要的作用，TGF-β作為成纖維細胞的趨化因子，募集成纖維細胞進入胸膜腔，刺激胸膜間皮細胞(PMC)產生血管內皮生長因子，刺激胸膜血管新生，誘導PMC膠原蛋白合成，抑制其降解，刺激PMC產生纖溶酶原激活物抑制劑，抑制纖維蛋白溶解，促使胸膜發生纖維化[7]。由于本研究顯示LXA4與TGF-β在胸膜纖維化進程中具有明顯負相關性，推斷LXA4可能也通過抑制TGF-β/Smads信號通路發揮抗胸膜纖維化作用。Smad 2/3是TGF-β特異性Smad受體，LXA4可抑制Smad 2/3分子的表達和核轉位，發揮抗TGF-β促胸膜纖維化反應的作用[3, 8]。李淑君等[9]研究表明，LXA4可抑制TGF-β誘導的TGF-β受體的表達，LXs受體激動劑可減少α平滑肌肌動蛋白的表達及膠原沉積，下調TGF-β的表達。B?rgeson等[10]研究發現，在體外環境中，LXA4抑制了TGF-β誘導的Smad 2的活性，可以緩解腎臟纖維化的病理進程。在腹膜纖維化模型中應用超聲微泡階段Smad 7基因轉染，抑制TGF-β的信號傳導可減輕腹膜纖維化[11]。結腸的纖維化延緩亦與LAX4阻斷TGF-β及其下游Smad 3信號通路有關。

同時，由于結核病為T淋巴細胞介導的免疫反應，TGF-β通過抑制T淋巴細胞的增殖及其功能，或通過細胞表面誘導凋亡因子(FAS)及其配體(FASL)系統調節T淋巴細胞和其他免疫細胞的凋亡；促進結核分枝桿菌的胞內生長，影響結核病的病情轉歸[12]。TGF-β所介導的免疫反應還參與了結核肉芽腫的形成。LXA4通過抑制TGF-β，提高巨噬細胞抗分枝桿菌的活性，恢復細胞對結核分枝桿菌的反應，并提高巨噬細胞對結核分枝桿菌的殺傷能力[13]。LXA4可以與多種免疫細胞、免疫調節介質之間存在密切聯系，調節免疫應答，在結核性胸膜炎患者胸膜纖維化進程中發揮作用。

綜上所述，LXA4在結核性胸膜炎胸膜纖維化患者中存在高表達，且與TGF-β具有明顯負相關性，LXA4可能通過作用TGF-β及下游Smad通路，發揮抗胸膜增厚及纖維化的作用，但其機制尚需通過進一步的研究加以驗證。

志謝山東大學高琦老師對本文統計學方法和內容進行了悉心指導和修改！